含雙熒光報告基因的轉基因載體的應用.pdf

1、綠色熒光蛋白與紅色熒光蛋白自發(fā)現(xiàn)以來，就因易于檢測、熒光穩(wěn)定、無毒害、種屬通用性、易于構建載體、可進行活細胞定位定時觀察等特性而得到廣泛應用。其應用領域涉及生命科學的各個領域，包括研究基因表達的調控元件、增強子捕獲、蛋白定位、研究基因表達的時空特性和空間定位、發(fā)育分子機理、篩選藥物、臨床檢驗、轉基因動物和植物的篩選標記以及對病毒顆粒定位、蛋白質相互作用等方面。因此我們構建了含雙熒光報告基因的不同轉基因載體分別用于不同目的的轉基因實驗。<

2、br>　　 首先，為了探索團頭魴β-actin啟動子在家蠶BmN細胞和家蠶體內的活性，將轉基因載體pigA3GFPAβdsRed和輔助質粒混合，通過脂質體介導轉染BmN細胞和利用精子介導法導入家蠶受精卵，48 h后，可以觀察到同時發(fā)綠色熒光和紅色熒光的家蠶細胞，7天后，可觀察到蠶卵具有綠色熒光和紅色熒光，表明來自團頭魴的β-actin啟動子在家蠶BmN細胞中具有活性，隨著穩(wěn)定轉化細胞的傳代，綠色熒光穩(wěn)定存在，而紅色熒光會逐漸減弱直至檢

3、測不到，暗示β-actin啟動子不能在家蠶中用于驅動外源基因穩(wěn)定表達。
　　 然后，為探索來源于昆蟲的piggyBac(PB)轉座子在鯉科魚轉基因中的適用性，在PB轉座子基礎上構建了兩個轉基因載體：pigA3 GFP-CMVDsRed-IEneo與pigA3GFPAβDsRed，每個轉基因載體分別與輔助質粒pigA3、pigCMV組合對草魚腎臟細胞CIK進行共轉染，都得到了同時具有綠色熒光和紅色熒光的CIK細胞，說明啟動子PAB

4、、PA3、Pcmv在CIK細胞具有啟動活性。根據(jù)轉化細胞可穩(wěn)定傳代和PCR驗證結果，認證外源基因插入到細胞基因組，證明PB轉座子在CIK具有轉座活性。將輔助質粒pigA3分別與轉基因載體vigA3GFP、pigA3GFPAβDsRed以脂質體-精子介導法共同導入金魚卵細胞，根據(jù)綠色熒光和紅色熒光的共表達篩選轉基因金魚，再經PCR、Southern雜交鑒定，表明得到了轉基因金魚，說明PB轉座子在金魚體內具有轉座活性。
　　 此外，

5、為了探索家蠶核型多角體病毒的多角體蛋白包埋特性，構建了含有綠色熒光蛋白基因（gfp）和紅色熒光蛋白基因(dsRed)的表達載體plZT-DsRed。用該載體轉染家蠶卵巢細胞系BmN，并以吉歐霉素(zeocin)篩選得到穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的細胞系，表明表達載體plZT-DsRed可以作為轉基因載體在BmN細胞使用；進一步以野生型家蠶核型多角體病毒(BmNPV)感染該細胞系，熒光觀察發(fā)現(xiàn)部分多角體可以發(fā)出綠色熒光和紅色熒光，