蓖麻蠶孵化酶基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建.pdf

1、蓖麻蠶（Philosamia cynthia ricini，eri-silkworm）是室內(nèi)飼養(yǎng)的重要經(jīng)濟昆蟲，以蓖麻葉為主要飼料，屬于鱗翅目大蠶蛾科。包括家蠶、柞蠶、野蠶、桑蟥及小菜蛾在內(nèi)幾種鱗翅目昆蟲孵化酶基因cDNA業(yè)已克隆報道，本文我們對蓖麻蠶孵化酶基因進(jìn)行研究。
　　根據(jù)已報道鱗翅目昆蟲孵化酶的基因保守序列，設(shè)計合成兼并性引物，以蓖麻蠶轉(zhuǎn)青卵cDNA為模版，克隆獲得部分蓖麻蠶孵化酶基因（PcrHE）序列，然后通過RACE

2、-PCR和序列拼接獲得蓖麻蠶孵化酶基因全長序列。PcrHE全長cDNA為962bp，其中包含3’UTR、5’UTR和885bp的開放閱讀框，共編碼294個氨基酸，N端16個氨基酸殘基為信號肽序列。序列比對的同源性分析顯示PcrHE與ApHEL，BmandHE，BmHE，RmHE，PxHE，BmHEⅡ，CuefHCE，DmHEHS，MLCE，XHE，EHE12，ZHCE1，MHCE23，TuHE，Aatacin和QHE的蛋白功能區(qū)序列相似

3、性分別為92.3％，84.2%，83.3%，82.4%，79.5%，76.1%，44.7%，43.6%，33.9%，33.7%，32.3%，32.3%，32.1%，31.7%，31.4%和30.8%，根據(jù)進(jìn)化樹分析顯示蓖麻蠶與柞蠶的親緣關(guān)系最近。根據(jù)同源建模的方法對 PcrHE進(jìn)行了三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測，顯示其與蝲蛄金屬蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)相似，利用 PROCHECK對所建蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了評價，模擬得到的PcrHE蛋白三維結(jié)構(gòu)有90.2%位于合

4、理區(qū)域內(nèi)，理論上表明蛋白三維結(jié)構(gòu)是可靠的。
　　通過RT-PCR的方法發(fā)現(xiàn)，在蓖麻蠶卵胚胎發(fā)育期不同階段中，可以在胚胎發(fā)育早期檢測到 PcrHE轉(zhuǎn)錄本，維持在較低水平，孵化時達(dá)到最高值，表明 PcrHE可能與孵化過程相關(guān)。另外，PcrHE轉(zhuǎn)錄本可在幼蟲的中腸和精巢中檢測到，推測PcrHE可能還有食物消化、精子發(fā)生等其它生物學(xué)功能。
　　將PcrHE的成熟酶序列、去信號肽序列、ORF序列對應(yīng)的基因序列分別克隆到原核表達(dá)系統(tǒng)pE

5、T28a中進(jìn)行蛋白原核表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測蛋白的表達(dá)，并用Western Blot進(jìn)行驗證。最后克隆了家蠶孵化酶基因啟動子（BmHEⅡp），由其驅(qū)動蓖麻蠶孵化酶基因，分別構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒pSL-3XP3-EGFP/BmHEⅠp-PcrHE，pSL-3XP3-EGFP/BmHEⅡp-PcrHE，并嘗試將其用顯微注射方法導(dǎo)入到家蠶卵中，以期在個體水平驗證蓖麻蠶孵化酶的功能。這些研究結(jié)果為闡明蓖麻蠶卵孵化的分子機理提供分子依據(jù)，