小鼠Bmall基因啟動子的克隆及其熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建.pdf

1、目的:Bmal1基因又名MOP3或ARNTL(aryl-hydrocarbon receptor nuclear translocator like protein)，是重要的轉(zhuǎn)錄因子，于1997年被實(shí)驗人員成功克隆。Bmal1基因包含Per-ARNT-Sim(PAS)和bHLH(basic Helix-Loop-Helix)結(jié)構(gòu)域，具有結(jié)合DNA并作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能。多種模式生物中均存在Bmal1同源基因。其中，大鼠Bma

2、l1基因定位于1號染色體。利用報告基因系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)Bmal1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游816bp到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游99bp區(qū)段的轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)。序列比對發(fā)現(xiàn)，這一區(qū)段含有多個轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，對于Bmal1轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要的因子也結(jié)合于這一區(qū)域。最新研究表明DNA甲基化對于Bmal1的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮著核心調(diào)控作用，而受甲基化調(diào)控的CpG島也位于上述915bp區(qū)段。因此，該915bp的區(qū)段被廣泛用于Bmal1基因轉(zhuǎn)錄活性的研究。
　　Bmal1基因并非在

3、所有的組織或細(xì)胞中均有表達(dá)。本實(shí)驗室的研究成果表明，胚胎干細(xì)胞在Bmal1的表達(dá)層面即表現(xiàn)出異質(zhì)性。一部分細(xì)胞表現(xiàn)為Bmal1基因陽性，另一部分細(xì)胞表現(xiàn)為Bmal1陰性。這種異質(zhì)性在胸腺和睪丸中也有所體現(xiàn)。目前尚無有效的方法能夠?qū)mal1陽性和陰性的細(xì)胞區(qū)分篩選出來并進(jìn)行后續(xù)的研究。本課題為了解決這一技術(shù)瓶頸，利用基因工程的方法和技術(shù)構(gòu)建pLV-Bmal1-mCherry-EF1-copGFP-T2A-puro雙熒光載體。使我們可以很

4、便利的研究Bmal1啟動子在活體細(xì)胞和組織的生物學(xué)特性。
　　方法:我們首先明確Bmal1基因啟動子區(qū)段。該啟動子起始于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游816位堿基，延伸至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游99位堿基，全長915個堿基。這一區(qū)段含有多個轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，包括SP1，AP1，NF-Y。Rev-erb alpha，Rev-erb beta，RORa，RORb等對于Bmal1轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要的因子也結(jié)合于這一區(qū)域。對于Bmal1的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮著重要調(diào)控作用的D

5、NA甲基化影響的也是這一區(qū)段。該915bp的區(qū)段被廣泛用于Bmal1基因轉(zhuǎn)錄活性的研究。我們使用高保真酶，以小鼠肝臟基因組DNA為模板，擴(kuò)增Bmal1啟動子序列。通過雙酶切將Bmal1基因啟動子克隆到慢病毒載體pLV-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro中，從而得到中間克隆pLV-Bmal1-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro。而后再次通過雙酶切，將紅色熒光蛋白(mCherry)克隆入pLV-Bmal1-M

6、CS-EF1-copGFP-T2A-puro中，從而得到最終目的克隆pLV-Bmal1-mCherry-EF1-copGFP-T2A-puro。將該克隆與pLP1、pLP2、pLP3，共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝。收獲病毒并經(jīng)超離心純化獲得濃縮病毒。獲得的病毒感染293T細(xì)胞檢測病毒滴度。
　　結(jié)果:以小鼠基因組DNA為模版，擴(kuò)增得到Bmal1基因啟動子區(qū)段。經(jīng)過兩步克隆成功最終目的克隆pLV-Bmal1-mCherry-E

7、F1-copGFP-T2A-puro，酶切和測序證實(shí)結(jié)構(gòu)正確。該克隆中存在兩套報告基因系統(tǒng)，其中紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)錄為Bmal1啟動子所控制，綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)錄為組成型啟動子EF1α所控制。之所以這樣設(shè)計，是考慮到慢病毒感染細(xì)胞的效率可能達(dá)不到100％。由于EF1α幾乎表達(dá)于所有種類的組織和細(xì)胞，當(dāng)病毒成功感染靶組織或細(xì)胞時，細(xì)胞將表達(dá)綠色熒光蛋白，并發(fā)綠光。而未受病毒感染的細(xì)胞將不表達(dá)綠色熒光蛋白，從而不發(fā)光。只有發(fā)綠光的細(xì)胞才被認(rèn)為是