斑馬魚生長抑素轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建及啟動(dòng)子活性分析.pdf

1、生長抑制激素是一類肽類激素,也稱之為生長激素抑制激素以及生長激素釋放抑制因子,它能調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)而且通過與G蛋白偶聯(lián)的生長抑素受體來影響神經(jīng)傳遞及細(xì)胞增生。生長抑素通過選擇性剪接前蛋白原形成有兩種活性形式:一種是14氨基酸,另一種是28個(gè)氨基酸。硬骨魚中包含有6個(gè)不同的生長抑素基因并被分別命名為ss1、ss2、ss3、ss4、ss5、ss6,六種不同的配體基因以及多種不同的受體使得生長抑素的作用十分廣泛。
　　 斑馬魚生長抑素1

2、主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及胰臟中表達(dá),本研究以Tol2轉(zhuǎn)座子技術(shù)為依托,通過Gateway技術(shù),成功地將ssl與遍在表達(dá)的啟動(dòng)子及EGFP熒光報(bào)告基因重組到一個(gè)包含有可被Tol2轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列的載體中,通過將這一重組載體(100ng/ul)與體外轉(zhuǎn)錄出來的Tol2 mRNA(100ng/ul)按1:1比例共注射到1-2細(xì)胞期的斑馬魚胚胎細(xì)胞中來分析其瞬時(shí)表達(dá)模式,而對照組只注射50ng/ul的質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn):在CMV/SP6遍在表達(dá)啟動(dòng)子的作用

3、下,EGFP綠色熒光在斑馬魚胚胎中呈現(xiàn)全身性表達(dá);挑選了24hpf發(fā)熒光的胚胎對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn):Tol2 mRNA與質(zhì)粒共注射的斑馬魚胚胎中綠色熒光約占56.79％左右,而只注射重組質(zhì)粒的胚胎這一效率有大約27.45％;只注射質(zhì)粒的對照組胚胎EGFP的表達(dá)模式為嵌合型表達(dá),而共注射組則更傾向于片狀或帶狀表達(dá);3dpf時(shí)質(zhì)粒對照組和共注射組熒光胚胎占分別占5.54％和34.08％,這說明共注射組表達(dá)更穩(wěn)定。
　　 生長抑素4

4、主要在內(nèi)分泌胰臟以及胚胎早期發(fā)育過程中的底板中表達(dá)。借助于生物信息學(xué)軟件分析斑馬魚ss4翻譯起始位點(diǎn)上游2467bp的核苷酸序列中對其表達(dá)調(diào)控起作用的潛在順式作用元件。我們發(fā)現(xiàn)在斑馬魚ss4可能參與肝胰臟發(fā)育、心血管形成等生命過程。我們克隆了這段區(qū)域并將其分為長度大小不等的五段分別亞克隆到pGL3-basic vector中,然后將其轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,利用Promega雙熒光報(bào)告檢測試劑盒來檢測不同啟動(dòng)子活性的強(qiáng)弱。以翻譯起始位點(diǎn)A+