天然化合物誘導(dǎo)Klotho啟動(dòng)子活性及Klotho啟動(dòng)子分析.pdf

1、Klotho是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的衰老相關(guān)基因,Klotho突變小鼠表現(xiàn)出如短壽、不育、異位鈣化,動(dòng)脈硬化、皮膚萎縮、骨質(zhì)疏松和肺氣腫等眾多衰老癥狀,對(duì)Klotho過表達(dá)小鼠的分析表明Klotho蛋白作為激素有抑制衰老的功能。所以,篩選Klotho啟動(dòng)子激活劑,調(diào)節(jié)Klotho基因表達(dá),提高Klotho基因表達(dá)對(duì)研究Klotho蛋白功能和衰老機(jī)制,防治衰老相關(guān)疾病具有重要的意義。在之前的研究中,我們構(gòu)建了Klotho啟動(dòng)子-螢光素酶報(bào)告基因載體

2、,轉(zhuǎn)染人腎胚胎細(xì)胞HEK293,并利用0.0006％的雙氧水處理(孵育6小時(shí))轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞得到其氧化應(yīng)激模型。利用該細(xì)胞模型,我們?cè)谔烊划a(chǎn)物中篩選出了一個(gè)能激活Klotho啟動(dòng)子活性的天然小分子化合物——紫花前胡內(nèi)酯。
　　本文中,我們?cè)谶@一細(xì)胞模型上重新驗(yàn)證了這一化合物的活性,并測(cè)定了其EC50值為1.60μg/ml(6.6μM)。我們用500mg/kg·day濃度的D-半乳糖注射ICR小鼠6周,建立亞急性衰老模型小鼠,然后按5

3、mg/kg·day和10mg/kg·day兩種濃度給衰老模型小鼠腹腔注射紫花前胡內(nèi)酯30天,空白對(duì)照組和衰老對(duì)照組注射藥劑溶劑,然后檢查各組生化指標(biāo)和衰老相關(guān)基因Klotho表達(dá)的變化。結(jié)果,衰老組紅細(xì)胞SOD水平較空白對(duì)照組顯著下降,血清MDA水平較空白對(duì)照組顯著增高;而給予10mg/kg·day和5mg/kg·day紫花前胡內(nèi)酯能提高衰老模型小鼠紅細(xì)胞SOD水平,降低血清MDA水平。衰老模型小鼠血磷、血鈣水平較空白對(duì)照對(duì)小鼠都有顯著

4、上升,而給予10mg/kg·day紫花前胡內(nèi)酯能下調(diào)模型小鼠的血磷水平。此外肝臟中SOD水平和MDA水平?jīng)]有顯著差異,腎臟中Klotho基因的表達(dá)水平在各組中沒有顯著差異。為了研究Klotho基因的表達(dá)調(diào)控和其中紫花前胡內(nèi)酯的響應(yīng)元件,我們克隆了人Klotho基因5’端側(cè)翼4.2Kb長(zhǎng)度的啟動(dòng)子序列。經(jīng)生物信息學(xué)分析,Klotho基因啟動(dòng)子序列不含TATA BOX元件,在其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)有多個(gè)SP1位點(diǎn)。
　　我們構(gòu)建了一系列5’側(cè)

5、翼或者3’側(cè)翼缺失的啟動(dòng)子片段和螢光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒,并用來轉(zhuǎn)染人腎胚胎細(xì)胞HEK293。其結(jié)果顯示Klotho基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)檗D(zhuǎn)錄起始點(diǎn)至-400bp,在-127bp到-243bp之間存在轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合位點(diǎn),在-1.6Kb到-3Kb中存在遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)域。紫花前胡內(nèi)酯的響應(yīng)元件位于轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)到-127bp之間。此外,用同樣誘導(dǎo)氧化應(yīng)激作用的百草枯處理細(xì)胞(150μM,6小時(shí))能顯著提高Klotho基因啟動(dòng)子的活性,其響應(yīng)區(qū)域?yàn)檗D(zhuǎn)