水稻鎘誘導(dǎo)啟動(dòng)子的分離和功能分析.pdf

1、水稻是我國主要的糧食作物之一，隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，環(huán)境和土壤中的重金屬，特別是重金屬鎘，在水稻各個(gè)組織積累，影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。鎘在環(huán)境中不能降解，可通過食物鏈嚴(yán)重危害人類的健康。降低和消除鎘污染成為一個(gè)亟待解決的問題。通過換土、優(yōu)化水肥或者全生育期淹水等措施都可以緩解鎘對(duì)水稻的毒害，降低稻米中的鎘含量，但這會(huì)大大增加種植成本。因此，從遺傳上改良水稻品種的耐鎘性，選育鎘積累量低的品種，是減少稻米鎘污染的一個(gè)經(jīng)濟(jì)且有效的途徑。
　　

2、植物主要的應(yīng)激反應(yīng)是基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這主要取決于啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子只在特定環(huán)境下表達(dá)，可避免目的基因的過量表達(dá)對(duì)植物的傷害。因此，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為研究脅迫耐受性的調(diào)控機(jī)制提供了重要資源。而且，目前主要集中在對(duì)功能基因的研究，對(duì)水稻鎘誘導(dǎo)啟動(dòng)子的研究很少，本文我們鑒定和分離了水稻中三個(gè)代表性的響應(yīng)鎘的啟動(dòng)子，并對(duì)其活性進(jìn)行了分析。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　(1)通過基因芯片分析和qRT-PCR鑒定，找出三個(gè)

3、主要受到重金屬鎘誘導(dǎo)表達(dá)的基因，分別為Os GSTU37、OsHSP18.6和OsGSTU5。
　　(2)克隆上述的3個(gè)水稻鎘響應(yīng)基因的啟動(dòng)子，分別命名為POsGSTU37、POsHSP18.6和POsGSTU5。構(gòu)建了這三個(gè)啟動(dòng)子與GUSplus報(bào)告基因的融合表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化獲得20、25和27株陽性轉(zhuǎn)基因水稻植株。
　　(3)對(duì)3個(gè)啟動(dòng)子POsGSTU37、POsHSP18.6和POsGSTU5受鎘

4、誘導(dǎo)后的組織表達(dá)活性進(jìn)行定性和定量分析。通過對(duì)相應(yīng)啟動(dòng)子的T3代轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉組織進(jìn)行GUS化學(xué)染色，與未處理相比，鎘誘導(dǎo)后其根、莖、葉組織都有不同程度的著色，表明這三個(gè)啟動(dòng)子是鎘強(qiáng)誘導(dǎo)啟動(dòng)子。同時(shí)，對(duì)3個(gè)啟動(dòng)子P OsGSTU37、POsHSP18.6和POsGSTU5活性進(jìn)行qRT-PCR定量分析，結(jié)果表明POsGSTU和POsGSTU37受鎘誘導(dǎo)24 h后的活性和組成型啟動(dòng)子POsACTIN的活性相當(dāng)，POsHSP18.6

5、表現(xiàn)出比POsACTIN更高的鎘誘導(dǎo)活性，葉組織鎘誘導(dǎo)倍數(shù)為POsACTIN的1.33倍，根的鎘誘導(dǎo)倍數(shù)為POsACTIN的5.38倍。
　　(4)在短期高濃度鎘誘導(dǎo)下(72h)，啟動(dòng)子POsGSTU37、POsHSP18.6和POsGSTU5表現(xiàn)出不同的鎘誘導(dǎo)應(yīng)答模式。隨著鎘誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，POsGSTU37的活性不斷增加，在72 h時(shí)達(dá)到最高，是未誘導(dǎo)的880倍。POsHS18.6活性在鎘誘導(dǎo)初期受到強(qiáng)烈的上調(diào)表達(dá)，8h誘導(dǎo)倍

6、數(shù)最高，約為1220.8倍，后隨著時(shí)間增加其誘導(dǎo)活性不斷降低。POsGSTU5的本底表達(dá)水平較高，4h的鎘誘導(dǎo)倍數(shù)達(dá)24倍。隨后鎘誘導(dǎo)活性保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。
　　(5)定量分析了三個(gè)鎘誘導(dǎo)啟動(dòng)子在長(zhǎng)期低濃度鎘誘導(dǎo)下的表達(dá)模式，得出POsGSTU5和POsGSTU37根組織的活性顯著高于葉組織中的，這可能是由于水稻不同組織鎘積累濃度不同造成的。P OsGSTU37驅(qū)動(dòng)的GUSplus的表達(dá)水平隨著鎘脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，在

7、20天達(dá)到最高。不同的是，P OsGSTU5和POsHSP18.6轉(zhuǎn)基因植株GUSplus的表達(dá)水平不依賴于鎘脅迫時(shí)間的長(zhǎng)短而增加。與4天未經(jīng)鎘處理的轉(zhuǎn)基因植株的根和葉GUSplus的表達(dá)量相比，POsGSTU3720天的根誘導(dǎo)倍數(shù)最高，P OsHSP18.65天的葉子誘導(dǎo)倍數(shù)最高。
　　(6)分析了不同金屬Ni、Pb、As、Co、Cu、Fe、Zn和Mn對(duì)鎘誘導(dǎo)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株的誘導(dǎo)活性。Ni誘導(dǎo)下，POsGSTU5轉(zhuǎn)基因植株的G

8、USplus的誘導(dǎo)表達(dá)量最高，其誘導(dǎo)倍數(shù)達(dá)119.5倍。Pb和As處理下，POsGSTU5的活性也被強(qiáng)誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，而金屬Cu、Fe、Zn、Mn和Co對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)量很低。金屬Ni、Cu、Pb、As和Co能強(qiáng)烈誘導(dǎo)POsGSTU37，該啟動(dòng)子受金屬M(fèi)n誘導(dǎo)低一些，但也增加了其GUSplus的表達(dá)量(P＜0.01)，然而Zn和Fe對(duì)POsGSTU37活性的上調(diào)不顯著。POsHSP18.6與陰性對(duì)照相比，各種金屬都強(qiáng)誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)基因植株GUSpl

9、us的表達(dá)，其中Ni、Cu、As和Co對(duì)POsHSP18.6誘導(dǎo)比Pb、Fe、Mn和Zn對(duì)其的誘導(dǎo)強(qiáng)的多。
　　(7)分別對(duì)三個(gè)鎘誘導(dǎo)啟動(dòng)子進(jìn)行功能分析，構(gòu)建了3個(gè)鎘誘導(dǎo)啟動(dòng)子相應(yīng)的截?cái)鄦?dòng)子與GUSplus報(bào)告基因的融合表達(dá)載體。并對(duì)三個(gè)鎘誘導(dǎo)啟動(dòng)子的鎘響應(yīng)元件進(jìn)行了初步分析，POsGSTU5鎘響應(yīng)元件定位在-2240～-1572bp，POsGSTU37各截?cái)鄦?dòng)子均有誘導(dǎo)，P OsHSP18.6鎘響應(yīng)元件定位至-437～-19