水稻鎘誘導啟動子的分離和功能分析.pdf

1、水稻是我國主要的糧食作物之一，隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，環(huán)境和土壤中的重金屬，特別是重金屬鎘，在水稻各個組織積累，影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。鎘在環(huán)境中不能降解，可通過食物鏈嚴重危害人類的健康。降低和消除鎘污染成為一個亟待解決的問題。通過換土、優(yōu)化水肥或者全生育期淹水等措施都可以緩解鎘對水稻的毒害，降低稻米中的鎘含量，但這會大大增加種植成本。因此，從遺傳上改良水稻品種的耐鎘性，選育鎘積累量低的品種，是減少稻米鎘污染的一個經(jīng)濟且有效的途徑。
　　

2、植物主要的應激反應是基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這主要取決于啟動子和轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用。誘導型啟動子只在特定環(huán)境下表達，可避免目的基因的過量表達對植物的傷害。因此，誘導型啟動子為研究脅迫耐受性的調(diào)控機制提供了重要資源。而且，目前主要集中在對功能基因的研究，對水稻鎘誘導啟動子的研究很少，本文我們鑒定和分離了水稻中三個代表性的響應鎘的啟動子，并對其活性進行了分析。具體實驗結果如下:
　　(1)通過基因芯片分析和qRT-PCR鑒定，找出三個

3、主要受到重金屬鎘誘導表達的基因，分別為Os GSTU37、OsHSP18.6和OsGSTU5。
　　(2)克隆上述的3個水稻鎘響應基因的啟動子，分別命名為POsGSTU37、POsHSP18.6和POsGSTU5。構建了這三個啟動子與GUSplus報告基因的融合表達載體，通過農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉(zhuǎn)化獲得20、25和27株陽性轉(zhuǎn)基因水稻植株。
　　(3)對3個啟動子POsGSTU37、POsHSP18.6和POsGSTU5受鎘

4、誘導后的組織表達活性進行定性和定量分析。通過對相應啟動子的T3代轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉組織進行GUS化學染色，與未處理相比，鎘誘導后其根、莖、葉組織都有不同程度的著色，表明這三個啟動子是鎘強誘導啟動子。同時，對3個啟動子P OsGSTU37、POsHSP18.6和POsGSTU5活性進行qRT-PCR定量分析，結果表明POsGSTU和POsGSTU37受鎘誘導24 h后的活性和組成型啟動子POsACTIN的活性相當，POsHSP18.6

5、表現(xiàn)出比POsACTIN更高的鎘誘導活性，葉組織鎘誘導倍數(shù)為POsACTIN的1.33倍，根的鎘誘導倍數(shù)為POsACTIN的5.38倍。
　　(4)在短期高濃度鎘誘導下(72h)，啟動子POsGSTU37、POsHSP18.6和POsGSTU5表現(xiàn)出不同的鎘誘導應答模式。隨著鎘誘導時間的延長，POsGSTU37的活性不斷增加，在72 h時達到最高，是未誘導的880倍。POsHS18.6活性在鎘誘導初期受到強烈的上調(diào)表達，8h誘導倍

6、數(shù)最高，約為1220.8倍，后隨著時間增加其誘導活性不斷降低。POsGSTU5的本底表達水平較高，4h的鎘誘導倍數(shù)達24倍。隨后鎘誘導活性保持在一個相對穩(wěn)定的水平。
　　(5)定量分析了三個鎘誘導啟動子在長期低濃度鎘誘導下的表達模式，得出POsGSTU5和POsGSTU37根組織的活性顯著高于葉組織中的，這可能是由于水稻不同組織鎘積累濃度不同造成的。P OsGSTU37驅(qū)動的GUSplus的表達水平隨著鎘脅迫時間的延長不斷增加，在

7、20天達到最高。不同的是，P OsGSTU5和POsHSP18.6轉(zhuǎn)基因植株GUSplus的表達水平不依賴于鎘脅迫時間的長短而增加。與4天未經(jīng)鎘處理的轉(zhuǎn)基因植株的根和葉GUSplus的表達量相比，POsGSTU3720天的根誘導倍數(shù)最高，P OsHSP18.65天的葉子誘導倍數(shù)最高。
　　(6)分析了不同金屬Ni、Pb、As、Co、Cu、Fe、Zn和Mn對鎘誘導啟動子轉(zhuǎn)基因植株的誘導活性。Ni誘導下，POsGSTU5轉(zhuǎn)基因植株的G

8、USplus的誘導表達量最高，其誘導倍數(shù)達119.5倍。Pb和As處理下，POsGSTU5的活性也被強誘導上調(diào)表達，而金屬Cu、Fe、Zn、Mn和Co對其誘導表達量很低。金屬Ni、Cu、Pb、As和Co能強烈誘導POsGSTU37，該啟動子受金屬Mn誘導低一些，但也增加了其GUSplus的表達量(P＜0.01)，然而Zn和Fe對POsGSTU37活性的上調(diào)不顯著。POsHSP18.6與陰性對照相比，各種金屬都強誘導其轉(zhuǎn)基因植株GUSpl

9、us的表達，其中Ni、Cu、As和Co對POsHSP18.6誘導比Pb、Fe、Mn和Zn對其的誘導強的多。
　　(7)分別對三個鎘誘導啟動子進行功能分析，構建了3個鎘誘導啟動子相應的截斷啟動子與GUSplus報告基因的融合表達載體。并對三個鎘誘導啟動子的鎘響應元件進行了初步分析，POsGSTU5鎘響應元件定位在-2240～-1572bp，POsGSTU37各截斷啟動子均有誘導，P OsHSP18.6鎘響應元件定位至-437～-19