水稻化學(xué)誘導(dǎo)基因及其啟動子序列的分離和分析.pdf

1、化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是植物基因控制表達(dá)的重要工具，在實(shí)驗(yàn)室和大田具有很大的應(yīng)用潛力，此類系統(tǒng)的實(shí)用性依賴于誘導(dǎo)的特異性和可調(diào)控性，以及使用成本和環(huán)境相容性。本研究用一種殺菌劑(丙環(huán)唑)和兩種除草劑安全劑(AD67、二氯乙酰胺)對水稻品種931I的幼苗進(jìn)行了誘導(dǎo)處理，采用差異顯示技術(shù)分離回收了誘導(dǎo)表達(dá)的基因片段，鑒定了10個(gè)陽性表達(dá)片段，對誘導(dǎo)基因的功能及轉(zhuǎn)錄元件進(jìn)行了分析，構(gòu)建了啟動子功能分析載體。主要結(jié)果如下： 1．差異表達(dá)基因片

2、段的獲得。采用3種誘導(dǎo)劑對3葉期水稻幼苗進(jìn)行誘導(dǎo)處理，處理時(shí)間分別為Oh(CK)、6h、12h、24h、48h、3d、4d、5d。通過對各處理總RNA的分離和差異顯示分析，獲得了67個(gè)差異表達(dá)片段。 2．差異表達(dá)基因片段陽性驗(yàn)證。根據(jù)不同的引物組合，對差異片段進(jìn)行了重?cái)U(kuò)增、電泳分離、轉(zhuǎn)膜和雜交，從中篩選得到經(jīng)反式Northern Blotting驗(yàn)證的10個(gè)陽性表達(dá)片段。 3．對陽性片段的序列分析。采用PMDl8-T載體

3、對陽性片段進(jìn)行克隆并測序。序列提交GeneBank進(jìn)行同源序列搜索，獲取基因功能的相關(guān)注釋。結(jié)果表明，Y2和Y11是未知序列；其他8個(gè)片段中Y1和Y7是未知功能的基因，Y3為二磷酸鳥苷一甘露糖一焦磷酸化酶基因(GDP-mannose pyrophosphorylase，GMP)，Y5為核糖體蛋白F因子蛋白(SM-F)，Y6為葉綠體1，5二磷酸核酮糖羧化酶(RBCL)基因，Y8為YIPPEE基因，Y9為Vps55蛋白，V10為富含甘氨酸的

4、RNA結(jié)合蛋白GRP/A。 4．對誘導(dǎo)基因的5'端啟動子區(qū)域進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄元件分析。因Y2和Y11無法進(jìn)行物理定位未做分析。在其他8個(gè)基因的5'端上游搜索到多種轉(zhuǎn)錄元件，其中除了TATA框等核心啟動子序列外，還有多個(gè)CAAT增強(qiáng)子調(diào)節(jié)元件。比較還發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)基因的上游普遍含有一些植物逆境應(yīng)答元件，出現(xiàn)頻率較高的有ABA應(yīng)答元件ABRE，光應(yīng)答元件ACE、BOX4、SPI和GATA，還有干旱應(yīng)答元件MBS和茉莉酸甲脂的應(yīng)答元件GGTCA

5、、TGACG-motif、CGTCA-motif等。另外，還發(fā)現(xiàn)參與抗病和逆境脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄元件(TC-rich repeats)，以及水楊酸應(yīng)答的TCA元件。 5．對GMPase和YIPPEE基因進(jìn)行了表達(dá)分析。RT-PCR和NORTHERN分析表明，兩個(gè)基因的表達(dá)都在誘導(dǎo)劑處理6小時(shí)開始出現(xiàn)上升，GMPase基因在處理2d時(shí)達(dá)到高峰，YIPPEE基因在誘導(dǎo)處理12h時(shí)達(dá)到高峰，兩基因在5天內(nèi)持續(xù)表達(dá)。 6．構(gòu)建了YIP