水稻PR基因啟動子分析及其在抗白葉枯病中的作用.pdf

1、PR基因(Pathogenesis-related gene，PR基因)是一類受病原菌或外源激素特異誘導的基因，研究證明它還和系統(tǒng)性獲得抗性(systematic acquired resistance，SAR)有著密切的關系，常用做植物SAR建立的特征分子標記。在基因表達的調(diào)控中，轉錄的起始是個關鍵。特定的啟動子起始過程常常決定了某個基因是否應當表達或表達量的多少。為了分析水稻Marker基因OsPR1b，OsPR5，OsPR10a這

2、三個PR基因的表達特性，以進一步了解它們的表達和調(diào)控機制。我們構建了相應的GUS融合表達載體，進行GUS組織化學分析和酶活測定。另外，利用Real-timePCR對其在植物激素、三種非生物因子和水稻黃單胞菌P10(PXO124)致病菌處理下的表達水平進行了分析。實驗研究的主要內(nèi)容如下:
　　1.根據(jù)NCBI中的水稻基因組序列從水稻品種日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Nipponbare)中擴增

3、得到了三個PR基因的部分啟動子序列，分別命名為OsPR1bp，OsPR5p，OsPR10ap，將它們放到啟動子分析網(wǎng)站上進行搜索和掃描，預測得到了多個脅迫響應元件。構建相應的OsPR1bp∷GUS，OsPR5p∷GUS,OsPR10ap∷GUS融合表達載體，采用農(nóng)桿菌介導的轉基因技術獲得轉基因植株。
　　2.Real-time PCR分析發(fā)現(xiàn)在健康植株中，OsPR1b在水稻葉片中的表達量較高，而在莖、根、愈傷和花器中的表達量非常低

4、;OsPR5的情況和OsPR1b類似，即葉片中的表達量相對較高;OsPR10a在各個組織中均有較強表達。
　　3.研究轉基因水稻的組織特異性時發(fā)現(xiàn):在OsPR1bp和OsPR5p轉基因植株的幼苗期，我們僅能在葉片中觀察到明顯的GUS活性，而在同時期的OsPR10ap轉基因植株的根、莖、葉中均能檢測到不同程度的GUS活性，其中根部的GUS表達特異性的分布在主根和側根根尖，頂端分生區(qū)處尤為明顯。轉基因植株幼葉中GUS染色大多集中在葉尖

5、和葉緣上，到了水稻秧苗期和開花期，葉片上的GUS染色基本呈現(xiàn)斑點狀的隨機分布，其中，苗期時的OsPR5p在葉鞘附近表現(xiàn)出了類似傷害誘導的GUS活性，開花期的劍葉切口處也能觀察到較為明顯的GUS表達，另外，在OsPR10ap轉基因植株的葉片茸毛中也觀察到了GUS染色。OsPR1bp在小花中并無表達，OsPR5p和OsPR10ap在穎殼和花藥上均有表達。三個啟動子在萌發(fā)的種胚內(nèi)均能啟動GUS基因的表達。在轉基因抗性愈傷中均存在GUS活性，其

6、中，OsPR1bp較弱，OsPR5p和OsPR10ap較強。
　　4.對野生型水培苗進行誘導表達的研究，實驗發(fā)現(xiàn):植物激素SA、MeJA、KT、ABA及NaCl、PEG可提高OsPR1b在葉片中的表達水平，MeJA、KT和NaCl的處理可提高其在根部的表達水平;MeJA、GA、KT、ABA及NaCl、H2O2可提高OsPR5在葉片中的表達水平，MeJA、KT、ET和NaCl、PEG、H2O2的處理可增加其在根部的表達水平;MeJA

7、、KT、ABA及NaCl、PEG可提高OsPR10a在葉片中的表達水平，MeJA、IAA、KT、ET和NaCl、PEG的處理可增強OsPR10a在根部的表達水平。這些激素在誘導基因在葉片和根部的表達程度上存在著明顯的差異。單獨接種致病菌株P10后24 hr對三個基因的表達影響不大，而當與MeJA共同處理后則可顯著增強OsPR1b，OsPR5在葉片中的表達。
　　5.對轉基因水培苗進行誘導表達研究發(fā)現(xiàn):JA可增強OsPR1bp在葉片

8、中的GUS表達活性;JA和KT可提高OsPR10ap在葉片中的GUS表達活性。Xoo的接菌處理可明顯改變OsPR10ap的表達模式。
　　此外，為了進一步明確PR基因在激素相關突變體中的表達調(diào)控變化以及激素在防御反應中所起的作用。我們還構建了部分甲基轉移酶相關基因(SAMdependent carboxyl methyltransferase gene，SAMT)的超表達載體，RNAi干涉載體，亞細胞定位載體以及啟動子分析表達載體