水稻抗白葉枯病相關(guān)基因的功能鑒定及入門載體的改進.pdf

1、水稻白葉枯病是一種由白葉枯病菌引起的細菌性病害，已嚴重影響到了水稻的品質(zhì)與產(chǎn)量?？寺】共』?，培育抗病品種才是經(jīng)濟有效的防治水稻白葉枯病方法。
　　本研究克隆了22個水稻抗白葉枯病相關(guān)基因。其中4個基因是通過酵母雙雜篩選出的抗病相關(guān)基因，另外18個基因是對Y73接種白葉枯病菌后篩選出的抗病相關(guān)基因。Xa5是水稻感病抗病過程中的一個重要信號轉(zhuǎn)導節(jié)點；x a5是一個已知的抗病基因，它的抗病功能是由于其編碼的蛋白與Xa5有一個氨基酸的差

2、異；OmXa5是疣粒野生稻中Xa5的等位基因，而且它編碼的蛋白與Xa5、xa5均有差異。為了研究這22個基因的功能及它們與水稻抗白葉枯關(guān)鍵基因Xa5、xa5、OmXa5之間的互作關(guān)系，我們進行了一系列的研究。
　　22個互作候選基因分別與Xa5、xa5、OmXa5進行BiFC（雙分子熒光互補）互作鑒定后發(fā)現(xiàn)：Xa5與過氧化氫同工酶(Os02g0115700)、類組蛋白(Os05g0461400)互作發(fā)生在細胞核上，與類泛素蛋白(O

3、s09g0420800)互作同時發(fā)生在細胞核和細胞質(zhì)膜上，與其余的19個候選基因互作時沒有觀察到熒光信號；OmXa5與這22個候選基因的互作模式和 Xa5相同；xa5與過氧化氫同工酶(Os02g0115700)、類組蛋白(Os05g0461400)互作發(fā)生在細胞核上，與類泛素蛋白(Os09g0420800)和其余19個候選基因互作時沒有觀察到熒光信號，可見xa5與這22個候選基因的互作模式與Xa5不同。我們推測類泛素蛋白(Os09g04

4、20800)、過氧化氫同工酶(Os02g0115700)、類組蛋白(Os05g0461400)這三個蛋白可能是水稻抗病相關(guān)途徑中的重要調(diào)控因子；OmXa5的功能與Xa5相似，其突變的氨基酸可能對蛋白的功能無影響。
　　利用亞細胞定位技術(shù)對22個互作候選基因的表達產(chǎn)物進行了分析，為這些基因的功能研究提供了重要信息。22個候選基因中5個基因的sGFP融合蛋白定位于細胞核上，可能發(fā)揮了轉(zhuǎn)錄因子的功能；5個基因的s GFP融合蛋白定位于細

5、胞質(zhì)膜上，推測其功能可能是在細胞質(zhì)膜上調(diào)控物質(zhì)轉(zhuǎn)運；6個基因的sGFP融合蛋白同時定位于細胞核和細胞質(zhì)膜上；另外還有6個基因的s GFP融合產(chǎn)物亞細胞定位時沒有觀察到熒光定位信號。
　　在進行互作鑒定及亞細胞定位觀察時，我們采用的是快速靈活的Gate way重組技術(shù)。但在構(gòu)建入門載體時較低的線性化效率和連接效應(yīng)影響了實驗的進展。于是我們對現(xiàn)有的入門載體構(gòu)建系統(tǒng)進行改進，用內(nèi)切酶BciVI來線性化入門載體。BciVI線性化載體的效率

6、要遠遠高于XcmI，且在測試實驗中用BciVI線性化的T載體連接基因片段后陽性克隆數(shù)也比XcmI多出大約40％。長度在2000 bp內(nèi)的PCR片段都可以高效的連接到BciVI線性化后的T載體（大約50%的克隆中目的基因片段都以期望的方向連入了入門載體）。隨著片段長度的增加克隆數(shù)和克隆陽性率雖有下降，但最大仍可連入長度為4700 bp的基因片段。改進后的入門載體構(gòu)建方法具有穩(wěn)定高效的特點，將來可以用來更加高效的構(gòu)建Gate way入門載體