水稻幼苗中受硝酸鹽誘導的相關(guān)基因啟動子的克隆.pdf

1、作為轉(zhuǎn)錄水平上一種重要的調(diào)控元件，啟動子控制著基因在特定組織、特定發(fā)育階段以及一定環(huán)境條件下表達。目前，基因功能及調(diào)控外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中精確表達等方面的研究成為當前植物基因工程研究的重點，而這些工作的開展主要依靠一個合適的啟動子來實現(xiàn)。目前，國內(nèi)外在植物基因工程中最常用的啟動子是組成型啟動子和不同細胞或器官的特異性啟動子。組成型啟動子使目的基因恒定而持續(xù)表達，過度消耗細胞內(nèi)的物質(zhì)和能量，影響正常代謝；器官特異性啟動子雖然可以控制表達

2、的部位，但不能有效控制基因表達的時間和強度。誘導型啟動子則有希望解決這兩個方面的問題。利用誘導型啟動子與報告基因融合，研究基因表達規(guī)律，進一步對外源基因?qū)崿F(xiàn)定時、定點、定量的三維調(diào)控表達，具有重要的理論意義和實際應用價值。 研究表明，水稻幼苗在250μmol·L<'-1>-10 mmol·L<'-1>的硝酸鹽溶液中培養(yǎng)時即可誘導包括硝酸還原酶在內(nèi)的大量蛋白質(zhì)的表達，在無硝酸鹽的環(huán)境中時這種誘導作用又逐漸消失。本文對比分析了水稻(

3、Oryza Sativa)幼苗中受硝酸鹽誘導的基因，選擇了受硝酸鹽誘導表現(xiàn)較強的6個特異性的基因，克隆出各自基因?qū)?′側(cè)翼序列，并初步鑒定各序列在硝酸鹽誘導下的啟動子功能。為進一步研究其調(diào)控機理，為探討基于硝酸鹽誘導建立理想的“基因開關(guān)”的可行性奠定了基礎。主要研究成果如下： 本研究從水稻幼苗(兩優(yōu)287)中克隆出了6個可能受硝酸鹽特異誘導的基因的部分cDNA片段。通過半定量PCR鑒定分析，獲得了3個受硝酸鹽特異誘導的cDN

4、A片段，分別為cNR、cNiR和cGS。進一步定位了上述3個cDNA所對應的基因。在此基礎上，利用生物信息學分析水稻基因組數(shù)據(jù)庫并通過silicon cloning得到了上述3個基因的5′調(diào)控區(qū)域。利用PCR進行克隆并測序，序列分析表明3個序列長度分別為1187bp，1296bp，1643bp。序列經(jīng)啟動子PLACE軟件掃描分析，結(jié)果表明：3組序列中ATG上游、下游鄰近區(qū)域均存在多種啟動子的保守元件，如TA-box，CpG島，CAAT-

5、box等。 進而，將經(jīng)限制性酶切的上述3個啟動子序列分別克隆到表達載體pCAMBIAl391Z中報告基因 gus 的上游，構(gòu)建了新的植物表達載體 pCAMBIA-pro-NiR、pCAMBIA-pro-NR 和 pCAMBIA-pro-GS。所有載體經(jīng)酶切驗證后轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌EHA105中。通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織中，通過瞬時表達檢測了 GUS 的表達情況，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化 pCAMBIA-pro-GS 的愈傷組織在硝酸