二化螟誘導(dǎo)水稻表達(dá)的基因及二化螟特異誘導(dǎo)水稻啟動(dòng)子的克隆.pdf

1、二化螟(Chilosuppressalis)是一種為害嚴(yán)重的世界性水稻害蟲(chóng)，目前還未見(jiàn)水稻對(duì)二化螟防御反應(yīng)分子機(jī)制、水稻被二化螟取食特異誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子研究的報(bào)道。本研究的目的在于：將扣除雜交技術(shù)和cDNA點(diǎn)陣技術(shù)相結(jié)合，得到水稻被二化螟誘導(dǎo)表達(dá)的基因，推測(cè)水稻對(duì)二化螟防御反應(yīng)分子機(jī)制，克隆并鑒定水稻被二化螟特異誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。 將水稻被二化螟取食后葉鞘mRNA及對(duì)照mRNA分別作為tester和driver構(gòu)建cDNA扣除文庫(kù)

2、，文庫(kù)I以二化螟取食后葉鞘mRNA為tester，以對(duì)照mRNA為driver，文庫(kù)Ⅱ剛好相反。理論上，來(lái)自于文庫(kù)I的EST為二化螟誘導(dǎo)上升表達(dá)的基因，來(lái)自于文庫(kù)II的EST為二化螟誘導(dǎo)下降表達(dá)的基因。從兩個(gè)文庫(kù)中共挑取864個(gè)克隆測(cè)序，序列拚接后得到271條unisequence。通過(guò)BIASTN和BLASTX分析這些序列的功能，結(jié)果表明這些基因涉及到光合作用、基礎(chǔ)代謝、次生代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白降解、電子傳遞等多個(gè)代謝途徑，這說(shuō)明水稻

3、對(duì)二化螟的防御反應(yīng)是一個(gè)全基因組水平轉(zhuǎn)錄調(diào)整過(guò)程。 將這271個(gè)cDNA克隆、來(lái)自于本室明恢63全生育期平衡化cDNA文庫(kù)的113個(gè)克隆、陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照cDNA克隆抽提質(zhì)粒點(diǎn)在尼龍膜上，將二化螟取食后6h明恢63葉鞘及對(duì)照葉鞘總RNA反轉(zhuǎn)錄并用：32p標(biāo)記成探針與尼龍膜雜交，雜交重復(fù)2次。結(jié)果得到在兩次雜交中皆上升表達(dá)的基因12個(gè)，在兩次雜交中皆下降表達(dá)的基因5個(gè)。尼龍膜雜交得到的差異表達(dá)克隆大大少于扣除雜交得到的差異表達(dá)克

4、隆，但在這17個(gè)差異表達(dá)的克隆中，上升表達(dá)的基因基本上來(lái)自于文庫(kù)I(1個(gè)例外)，下降表達(dá)的基因基本上來(lái)自于文庫(kù)II(1個(gè)例外)，這說(shuō)明扣除雜交技術(shù)與cDNA點(diǎn)陣技術(shù)之間的主要差異在于兩者的靈敏度不同。 為了得到二化螟特異誘導(dǎo)表達(dá)的水稻啟動(dòng)子，從以上17個(gè)差異表達(dá)克隆中隨機(jī)挑取4個(gè)上升表達(dá)克隆進(jìn)行Northernblot分析。其中3個(gè)克隆同時(shí)被機(jī)械損傷和二化螟取食誘導(dǎo)。1個(gè)可能編碼胰凝乳蛋白酶抑制劑的克隆-B1-A04在二化螟取食

5、后急劇上升表達(dá)，但是機(jī)械損傷處理時(shí)其表達(dá)量幾乎與對(duì)照一樣，沒(méi)有明顯的變化。 通過(guò)PCR從基因組中克隆了B1-A04基因的啟動(dòng)子片段，如果將轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)定位為1，則該啟動(dòng)子片段覆蓋了-1569至＋446之間的區(qū)域，包括B1-A04基因部分編碼序列。將該片段(為了描述方便，命名為-1569)與GUS報(bào)告基因融合并通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到水稻品種中花11中。在轉(zhuǎn)基因植株中，二化螟未取食時(shí)，GUS基因在莖桿與幼穗中表達(dá)，在葉片與葉鞘中不表達(dá)；二

6、化螟取食6h后，GUS基因在葉鞘與莖桿中的表達(dá)活性明顯上升，但是葉片中仍然不表達(dá)。這說(shuō)明該啟動(dòng)子具有器官特異表達(dá)、發(fā)育階段特異表達(dá)的特點(diǎn)。GUS基因及內(nèi)源B1-A04基因的表達(dá)水平在外源茉莉酸、脫落酸處理前后沒(méi)有明顯的變化。 為了了解-1569片段可能的調(diào)控區(qū)域，本研究從-1569的5’-end進(jìn)行缺失，得到-1166至＋446(命名為-1166)、-582至＋446(命名為-582)、-371至＋446(命名為-371)、-1

7、12至＋446(命名為-112)4個(gè)截短的啟動(dòng)子片段。通過(guò)GUS活性測(cè)定及GUS組織染色可知在-1569位點(diǎn)至-1166位點(diǎn)、-1166位點(diǎn)至-582位點(diǎn)之間存在負(fù)調(diào)控順式因子，在未被二化螟取食時(shí)抑制GUS基因在葉鞘中表達(dá)，被二化螟取食后開(kāi)放。凝膠阻滯試驗(yàn)(EMSA)鑒定出7個(gè)與對(duì)照葉鞘核蛋白、二化螟取食后葉鞘核蛋白、機(jī)械損傷葉鞘核蛋白結(jié)合能力有差異的DNA探針，本文對(duì)這7段DNA對(duì)下游基因的可能調(diào)控作用進(jìn)行了討論。 本研究中得