二化螟誘導(dǎo)水稻表達的基因及二化螟特異誘導(dǎo)水稻啟動子的克隆.pdf

1、二化螟(Chilosuppressalis)是一種為害嚴(yán)重的世界性水稻害蟲，目前還未見水稻對二化螟防御反應(yīng)分子機制、水稻被二化螟取食特異誘導(dǎo)表達啟動子研究的報道。本研究的目的在于：將扣除雜交技術(shù)和cDNA點陣技術(shù)相結(jié)合，得到水稻被二化螟誘導(dǎo)表達的基因，推測水稻對二化螟防御反應(yīng)分子機制，克隆并鑒定水稻被二化螟特異誘導(dǎo)表達的啟動子。 將水稻被二化螟取食后葉鞘mRNA及對照mRNA分別作為tester和driver構(gòu)建cDNA扣除文庫

2、，文庫I以二化螟取食后葉鞘mRNA為tester，以對照mRNA為driver，文庫Ⅱ剛好相反。理論上，來自于文庫I的EST為二化螟誘導(dǎo)上升表達的基因，來自于文庫II的EST為二化螟誘導(dǎo)下降表達的基因。從兩個文庫中共挑取864個克隆測序，序列拚接后得到271條unisequence。通過BIASTN和BLASTX分析這些序列的功能，結(jié)果表明這些基因涉及到光合作用、基礎(chǔ)代謝、次生代謝、信號傳導(dǎo)、蛋白降解、電子傳遞等多個代謝途徑，這說明水稻

3、對二化螟的防御反應(yīng)是一個全基因組水平轉(zhuǎn)錄調(diào)整過程。 將這271個cDNA克隆、來自于本室明恢63全生育期平衡化cDNA文庫的113個克隆、陽性對照及陰性對照cDNA克隆抽提質(zhì)粒點在尼龍膜上，將二化螟取食后6h明恢63葉鞘及對照葉鞘總RNA反轉(zhuǎn)錄并用：32p標(biāo)記成探針與尼龍膜雜交，雜交重復(fù)2次。結(jié)果得到在兩次雜交中皆上升表達的基因12個，在兩次雜交中皆下降表達的基因5個。尼龍膜雜交得到的差異表達克隆大大少于扣除雜交得到的差異表達克

4、隆，但在這17個差異表達的克隆中，上升表達的基因基本上來自于文庫I(1個例外)，下降表達的基因基本上來自于文庫II(1個例外)，這說明扣除雜交技術(shù)與cDNA點陣技術(shù)之間的主要差異在于兩者的靈敏度不同。 為了得到二化螟特異誘導(dǎo)表達的水稻啟動子，從以上17個差異表達克隆中隨機挑取4個上升表達克隆進行Northernblot分析。其中3個克隆同時被機械損傷和二化螟取食誘導(dǎo)。1個可能編碼胰凝乳蛋白酶抑制劑的克隆-B1-A04在二化螟取食

5、后急劇上升表達，但是機械損傷處理時其表達量幾乎與對照一樣，沒有明顯的變化。 通過PCR從基因組中克隆了B1-A04基因的啟動子片段，如果將轉(zhuǎn)錄起始位點定位為1，則該啟動子片段覆蓋了-1569至＋446之間的區(qū)域，包括B1-A04基因部分編碼序列。將該片段(為了描述方便，命名為-1569)與GUS報告基因融合并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到水稻品種中花11中。在轉(zhuǎn)基因植株中，二化螟未取食時，GUS基因在莖桿與幼穗中表達，在葉片與葉鞘中不表達；二

6、化螟取食6h后，GUS基因在葉鞘與莖桿中的表達活性明顯上升，但是葉片中仍然不表達。這說明該啟動子具有器官特異表達、發(fā)育階段特異表達的特點。GUS基因及內(nèi)源B1-A04基因的表達水平在外源茉莉酸、脫落酸處理前后沒有明顯的變化。 為了了解-1569片段可能的調(diào)控區(qū)域，本研究從-1569的5’-end進行缺失，得到-1166至＋446(命名為-1166)、-582至＋446(命名為-582)、-371至＋446(命名為-371)、-1

7、12至＋446(命名為-112)4個截短的啟動子片段。通過GUS活性測定及GUS組織染色可知在-1569位點至-1166位點、-1166位點至-582位點之間存在負(fù)調(diào)控順式因子，在未被二化螟取食時抑制GUS基因在葉鞘中表達，被二化螟取食后開放。凝膠阻滯試驗(EMSA)鑒定出7個與對照葉鞘核蛋白、二化螟取食后葉鞘核蛋白、機械損傷葉鞘核蛋白結(jié)合能力有差異的DNA探針，本文對這7段DNA對下游基因的可能調(diào)控作用進行了討論。 本研究中得