稻縱卷葉螟與二化螟嗅覺基因的研究.pdf

1、本文對重要水稻害蟲稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）和二化螟(Chilosuppressalis)嗅覺過程中的幾個關(guān)鍵基因進(jìn)行了研究，獲得結(jié)果如下:
　　 一、從稻縱卷葉螟成蟲觸角中克隆了5條氣味結(jié)合蛋白(odorant-bindingproteins，OBPs) cDNA全長序列，分別命名為CmedGOBP1、CmedGOBP2、CmedPBP1、CmedOBP1和CmedOBP2。實(shí)時熒光定量PC

2、R結(jié)果表明，這5個OBP基因均大量表達(dá)于成蟲觸角。其中，CmedGOBP1、CmedGOBP2和CmedPBP1在非嗅覺組織中表達(dá)量極低，而CmedOBP1和CmedOBP2在腹部、足和翅中也有一定量的表達(dá)。將CmedGOBP2基因的cDNA序列連入pET22b載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌OrigamiB(DE3)菌株，原核表達(dá)并純化了CmedGOBP2蛋白，以1-NPN為熒光探針，研究了其與23種氣味分子的結(jié)合能力。CmedGOBP2對稻縱卷葉

3、螟的一種性信息素組分順-13-十八碳烯醛(cis-13-Octadecenal)的結(jié)合能力最強(qiáng)。此外，CmedGOBP2在結(jié)合過程中還可能存在pH介導(dǎo)的構(gòu)象變化。
　　 二、克隆了稻縱卷葉螟和二化螟嗅覺輔助受體(Olfactory co-receptor, Orco)的全長cDNA，CmedOrco和ChsupOrco。預(yù)測其編碼的蛋白均具有七次跨膜螺旋區(qū)域。使用Bac-to-Bac系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了CmedOrco和Chs

4、upOrco，細(xì)胞免疫熒光表明CmedOrco和ChsupOrco的跨膜方向均與G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)不同，為N端在胞內(nèi)，C端在胞外。CmedOrco和ChsupOrco均特異表達(dá)于觸角組織，且雌雄之間表達(dá)量相當(dāng)，在其它組織中表達(dá)量極低。ChsupOrco在二化螟卵期、幼蟲期和低齡蛹期表達(dá)量都很低，在高齡蛹期表達(dá)量開始升高，在成蟲期達(dá)到最高。
　　 三、克隆了稻縱卷葉螟和二化螟的感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron

5、membrane proteins，SNMPs)全長cDNA，分別命名為CmedSNMP1、CmedSNMP2、ChsupSNMP1和ChsupSNMP2。預(yù)測其編碼的蛋白均有兩處跨膜區(qū)，分別在靠近N端和C端的位置。計(jì)算了鱗翅目SNMPs之間的非同義突變與同義突變的比值(dN/dS)，表明SNMPs基因存在純化選擇(purifying selection)作用。使用Bac-to-Bac系統(tǒng)研究了SNMPs蛋白的跨膜方向，細(xì)胞免疫熒光表明

6、它們的N端和C端均在胞內(nèi)。RT-PCR顯示CmedSNMP1、CmedSNMP2、ChsupSNMP1和ChsupSNMP2在昆蟲的各組織中均有表達(dá)，但熒光定量PCR表明它們在觸角中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它非嗅覺組織。此外，在二化螟的卵期、幼蟲期和低齡蛹期，ChsupSNMP1和ChsupSNMP2的表達(dá)量較低，老熟蛹期表達(dá)量開始增加，至成蟲期達(dá)到最高。在整個蛹期和成蟲期，ChsupSNMP1的表達(dá)量均顯著高于ChsupSNMP2。

7、　　 四、從二化螟觸角中克隆獲得了一條細(xì)胞色素P450還原酶(cytochrome P450reductase，CPR) cDNA，命名為CsCPR。熒光定量PCR表明CsCPR在成蟲的觸角和幼蟲的中腸中表達(dá)量最高。因?yàn)镃PR的作用是為P450提供電子，因此CsCPR可能參與了P450系統(tǒng)介導(dǎo)的氣味分子清除過程。我們原核表達(dá)了CsCPR并研究了其還原酶活性，CsCPR降解底物細(xì)胞色素c的活性約為35.71±5.37μM/min/mg。