二化螟解毒代謝相關酯酶基因的篩選和表達分析.pdf

1、二化螟Chilosuppressalis(Walker)是水稻的重要害蟲之一，對我國水稻的穩(wěn)產、高產造成嚴重的影響，尤其在我國南方稻區(qū)經常連年爆發(fā)，為害嚴重，造成巨大的經濟損失。長期以來，防治二化螟主要以化學防治為主，有機磷類、氨基甲酸酯類等類殺蟲劑在二化螟防治中都得到廣泛的使用，但是持續(xù)、大量、尤其是不合理的使用殺蟲劑，也給二化螟造成很大的抗性選擇壓力，致使我國不同地區(qū)的二化螟對常用的殺蟲劑都產生了不同水平的抗性。
　　害蟲抗藥

2、性涉及到表皮穿透能力下降、解毒代謝能力增強和靶標分子敏感性下降。酯酶基因點突變、基因擴增和表達量上升是導致昆蟲體內解毒代謝能力增強的重要機制。此外，酯酶是一個龐大的超基因家族，在昆蟲體內不僅參與外源化合物的解毒，還具有營養(yǎng)代謝、信息傳導調控，以及保幼激素的代謝調控等重要功能。本文利用轉錄組數據，對二化螟體內的酯酶基因進行了克隆驗證，并利用誘導試驗篩選殺蟲劑代謝相關酯酶基因，克隆其全長，為進一步分析不同酯酶在不同殺蟲劑代謝中的作用提供理論

3、依據?，F將研究結果總結如下:
　　1.酯酶基因篩選驗證及殺蟲劑可誘導基因的分析
　　為了弄清二化螟體內參與殺蟲劑解毒代謝的酯酶基因，本章利用二化螟轉錄組數據，首先對各種酯酶基因進行了篩選和擴增驗證，結果獲得了68條不同的羧酸酯酶基因序列。此后通過誘導試驗，利用半定量RT-PCR對比分析不同酯酶在三唑磷和氯蟲苯甲酰胺誘導前后的表達量變化，通過電泳條帶的亮度尋找與解毒代謝相關的基因。結果發(fā)現，經氯蟲苯甲酰胺誘導后，供試二化螟體內

4、68條酯酶基因中有4條，Cs.EXE2、Cs.EXE4、Cs.EXE5、Cs.EXE6表達量明顯升高，三唑磷誘導后也有4條基因的表達量明顯上升，分別是Cs.EXE1、Cs.EXE3、Cs.EXE4、Cs.EXE5，其中有2條與氯蟲苯甲酰胺誘導的基因相同。分析認為這些基因可能分別參與了這2中殺蟲劑的解毒代謝，屬于殺蟲劑代謝相關的酯酶基因。
　　2.二化螟酯酶基因的全長克隆及同源性分析
　　本研究采用RACE技術將半定量篩選到的

5、與二化螟解毒代謝相關的六個酯酶基因進行全長克隆，分別命名為Cs.EXE1、Cs.EXE2、Cs.EXE3、Cs.EXE4、Cs.EXE5、Cs.EXE6，并利用序列分析軟件對全長序列進行分析。結果表明，六個基因的cDNA全長在1700bp-2500bp之間，開放閱讀框(ORF)在1400bp-1700bp之間，編碼約479-560個氨基酸，除Cs.EXE2外，Cs.EXE1、Cs.EXE3、Cs.XE4、Cs.EXE5和Cs.EXE6的

6、催化三聯體結構Ser-Glu-His，活性中心均具有為GXSXG結構，均具有酯酶基因的保守序列。經過同源性比對和系統(tǒng)進化樹分析，目的基因與家蠶、蜜蜂、赤擬谷盜等昆蟲酯酶基因存在極高的相似性，大都在84-99％之間。上述結果進一步證實所克隆的6個基因是二化螟的酯酶基因。
　　3.解毒代謝相關的酯酶基因的表達分析
　　由于二化螟酯酶基因較多，序列結構相似性較高，為了避免利用轉錄組數據中篩選片段進行半定量RT-PCR分析可能出現的

7、錯誤，本研究利用全長酯酶基因和定量PCR技術，對半定量RT-PCR篩選到的6個基因，重新進行誘導驗證。檢測氯蟲苯甲酰胺和三唑磷誘導前后目的基因的表達量情況，結果表明，通過定量PCR檢測到的目的基因的表達量與半定量RT-PCR篩選到的基因的表達趨勢相同，這6個酯酶基因的表達量在誘導后都出現了明顯的上調，氯蟲苯甲酰胺誘導后4個相關酯酶基因的表達量上升了2.5-3.5倍，三唑磷誘導后，其相關酯酶基因的表達量是對照表達量的1.5-7.5倍之間。