二化螟解毒代謝相關(guān)酯酶基因的篩選和表達(dá)分析.pdf

1、二化螟Chilosuppressalis(Walker)是水稻的重要害蟲(chóng)之一，對(duì)我國(guó)水稻的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)造成嚴(yán)重的影響，尤其在我國(guó)南方稻區(qū)經(jīng)常連年爆發(fā)，為害嚴(yán)重，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。長(zhǎng)期以來(lái)，防治二化螟主要以化學(xué)防治為主，有機(jī)磷類(lèi)、氨基甲酸酯類(lèi)等類(lèi)殺蟲(chóng)劑在二化螟防治中都得到廣泛的使用，但是持續(xù)、大量、尤其是不合理的使用殺蟲(chóng)劑，也給二化螟造成很大的抗性選擇壓力，致使我國(guó)不同地區(qū)的二化螟對(duì)常用的殺蟲(chóng)劑都產(chǎn)生了不同水平的抗性。
　　害蟲(chóng)抗藥

2、性涉及到表皮穿透能力下降、解毒代謝能力增強(qiáng)和靶標(biāo)分子敏感性下降。酯酶基因點(diǎn)突變、基因擴(kuò)增和表達(dá)量上升是導(dǎo)致昆蟲(chóng)體內(nèi)解毒代謝能力增強(qiáng)的重要機(jī)制。此外，酯酶是一個(gè)龐大的超基因家族，在昆蟲(chóng)體內(nèi)不僅參與外源化合物的解毒，還具有營(yíng)養(yǎng)代謝、信息傳導(dǎo)調(diào)控，以及保幼激素的代謝調(diào)控等重要功能。本文利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)二化螟體內(nèi)的酯酶基因進(jìn)行了克隆驗(yàn)證，并利用誘導(dǎo)試驗(yàn)篩選殺蟲(chóng)劑代謝相關(guān)酯酶基因，克隆其全長(zhǎng)，為進(jìn)一步分析不同酯酶在不同殺蟲(chóng)劑代謝中的作用提供理論

3、依據(jù)。現(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　1.酯酶基因篩選驗(yàn)證及殺蟲(chóng)劑可誘導(dǎo)基因的分析
　　為了弄清二化螟體內(nèi)參與殺蟲(chóng)劑解毒代謝的酯酶基因，本章利用二化螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，首先對(duì)各種酯酶基因進(jìn)行了篩選和擴(kuò)增驗(yàn)證，結(jié)果獲得了68條不同的羧酸酯酶基因序列。此后通過(guò)誘導(dǎo)試驗(yàn)，利用半定量RT-PCR對(duì)比分析不同酯酶在三唑磷和氯蟲(chóng)苯甲酰胺誘導(dǎo)前后的表達(dá)量變化，通過(guò)電泳條帶的亮度尋找與解毒代謝相關(guān)的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)氯蟲(chóng)苯甲酰胺誘導(dǎo)后，供試二化螟體內(nèi)

4、68條酯酶基因中有4條，Cs.EXE2、Cs.EXE4、Cs.EXE5、Cs.EXE6表達(dá)量明顯升高，三唑磷誘導(dǎo)后也有4條基因的表達(dá)量明顯上升，分別是Cs.EXE1、Cs.EXE3、Cs.EXE4、Cs.EXE5，其中有2條與氯蟲(chóng)苯甲酰胺誘導(dǎo)的基因相同。分析認(rèn)為這些基因可能分別參與了這2中殺蟲(chóng)劑的解毒代謝，屬于殺蟲(chóng)劑代謝相關(guān)的酯酶基因。
　　2.二化螟酯酶基因的全長(zhǎng)克隆及同源性分析
　　本研究采用RACE技術(shù)將半定量篩選到的

5、與二化螟解毒代謝相關(guān)的六個(gè)酯酶基因進(jìn)行全長(zhǎng)克隆，分別命名為Cs.EXE1、Cs.EXE2、Cs.EXE3、Cs.EXE4、Cs.EXE5、Cs.EXE6，并利用序列分析軟件對(duì)全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明，六個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)在1700bp-2500bp之間，開(kāi)放閱讀框(ORF)在1400bp-1700bp之間，編碼約479-560個(gè)氨基酸，除Cs.EXE2外，Cs.EXE1、Cs.EXE3、Cs.XE4、Cs.EXE5和Cs.EXE6的

6、催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)Ser-Glu-His，活性中心均具有為GXSXG結(jié)構(gòu)，均具有酯酶基因的保守序列。經(jīng)過(guò)同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，目的基因與家蠶、蜜蜂、赤擬谷盜等昆蟲(chóng)酯酶基因存在極高的相似性，大都在84-99％之間。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)所克隆的6個(gè)基因是二化螟的酯酶基因。
　　3.解毒代謝相關(guān)的酯酶基因的表達(dá)分析
　　由于二化螟酯酶基因較多，序列結(jié)構(gòu)相似性較高，為了避免利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選片段進(jìn)行半定量RT-PCR分析可能出現(xiàn)的

7、錯(cuò)誤，本研究利用全長(zhǎng)酯酶基因和定量PCR技術(shù)，對(duì)半定量RT-PCR篩選到的6個(gè)基因，重新進(jìn)行誘導(dǎo)驗(yàn)證。檢測(cè)氯蟲(chóng)苯甲酰胺和三唑磷誘導(dǎo)前后目的基因的表達(dá)量情況，結(jié)果表明，通過(guò)定量PCR檢測(cè)到的目的基因的表達(dá)量與半定量RT-PCR篩選到的基因的表達(dá)趨勢(shì)相同，這6個(gè)酯酶基因的表達(dá)量在誘導(dǎo)后都出現(xiàn)了明顯的上調(diào)，氯蟲(chóng)苯甲酰胺誘導(dǎo)后4個(gè)相關(guān)酯酶基因的表達(dá)量上升了2.5-3.5倍，三唑磷誘導(dǎo)后，其相關(guān)酯酶基因的表達(dá)量是對(duì)照表達(dá)量的1.5-7.5倍之間。