二化螟與褐飛虱氣味結(jié)合相關(guān)蛋白的基因克隆與功能分析.pdf

1、在長期的進(jìn)化過程中，昆蟲形成了高度靈敏的嗅覺系統(tǒng)，并以此來感受外界環(huán)境中的氣味物質(zhì)，從而做出相應(yīng)的行為或生理反應(yīng)，如尋找配偶、食物和棲息場所等。昆蟲的嗅覺分為外周和中樞神經(jīng)感受兩個(gè)過程，在外周神經(jīng)感受過程中，氣味結(jié)合蛋白(Odorant binding protein，OBP)和化學(xué)感受蛋白(Chemosensory protein，CSP)主要負(fù)責(zé)將進(jìn)入到感器腔內(nèi)的脂溶性氣味物質(zhì)結(jié)合并運(yùn)輸?shù)轿挥诟惺苌窠?jīng)膜上的氣味受體(Odorant

2、receptor, OR)，因此在嗅覺中起重要作用。二化螟Chilo suppressalis(Walker)與褐飛虱Nilaparvata lugens(St(a)l)分屬鱗翅目和半翅目，均是重要的水稻害蟲，對(duì)其氣味結(jié)合相關(guān)蛋白的研究，不僅有助于深入理解不同目昆蟲的嗅覺機(jī)制差異，而且可以為開發(fā)高效的行為調(diào)控技術(shù)提供新的靶標(biāo)基因，提高兩種害蟲的可持續(xù)防治水平。然而，相關(guān)研究很少，目前僅在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析、觸角電位等方面有個(gè)別報(bào)道。本研究

3、利用二化螟基因組/轉(zhuǎn)錄組與褐飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，得到18個(gè)二化螟氣味結(jié)合蛋白(OBP)基因和9個(gè)褐飛虱化學(xué)感受蛋白（CSP）基因的cDNA序列，其中15個(gè)二化螟OBP基因和9個(gè)褐飛虱CSP基因?yàn)閏DNA全長序列。在此基礎(chǔ)上，通過RT-PCR與qPCR技術(shù)，測定了這些基因在mRNA水平上的的組織和時(shí)間表達(dá)動(dòng)態(tài)，并利用體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)技術(shù)探討了二化螟OBP8的生理功能。研究結(jié)果為明確兩種水稻害蟲化感基因的多樣

4、性及其生理功能奠定了基礎(chǔ)。
　　1.二化螟OBP基因的克隆及序列分析
　　結(jié)合基因組數(shù)據(jù)分析并利用PCR技術(shù)，獲得了18個(gè)OBP基因的cDNA序列，其中10個(gè)為全長序列，分別為CsupOBP3、CsupOBP8、CsupOBP9、CsupOBP11、CsupOBP16、CsupOBP25、CsupOBP26、CsupOBP30、CsupOBP32和CsupOBP33。其中，CsupOBP3、CsupOBP16、CsupOBP

5、23、CsupOBP26這4個(gè)基因R有4個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，屬M(fèi)inus-C OBP。通過與其它鱗翅目昆蟲OBP的氨基酸序列的進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，18個(gè)二化螟OBP序列與其它鱗翅目昆蟲OBP有較高的一致性(Identity)。其中，CsupOBP9、CsupOBP23和CsupOBP24與其他基因的的最高一致性分別為43％、43％、41％，其它二化螟OBP基因與其它鱗翅目昆蟲OBP的一致性均大于50％，尤其是CsupOBP11、CsupOB

6、P32分別達(dá)到82％、79％。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，二化螟CsupPBP4與其它鱗翅目昆蟲的PBP聚于同一分支。
　　2.二化螟OBP基因的時(shí)間和組織表達(dá)動(dòng)態(tài)
　　利用RT-PCR技術(shù)，檢測了二化螟30個(gè)OBP基因在幼蟲不同齡期頭部及身體、雌雄蛹以及成蟲不同組織中的表達(dá)量。結(jié)果表明，在幼蟲期，CsupOBP1、CsupOBP3、CsupOBP6、CsupOBP8、CsupOBP9、CsupOBP10、CsupOBP18以及Csu

7、pOBP24在頭部的表達(dá)量均明顯高于其他組織，其中CsupOBP1、CsupOBP8、CsupOBP10、CsupOBP24在頭部特異表達(dá);在成蟲期，CsupPBP4、CsupOBP1、CsupOBP3、CsupOBP4、CsupOBP8、CsupOBP10、CsupOBP11以及CsupOBP24在兩性觸角中特異性表達(dá)，CsupOBP20、CsupOBP30、CsupOBP33在兩性觸角中高表達(dá);CsupOBP18在雌蟲觸角中特異性表

8、達(dá)。這些基因可能在二化螟的嗅覺或味覺感受中起作用。
　　3.二化螟CsupOBP8的原核表達(dá)及配體結(jié)合能力分析
　　鑒于CsupOBP8基因只在幼蟲期頭部和成蟲期雌雄觸角中表達(dá)，推測其在二化螟的嗅覺及味覺中起作用，為此進(jìn)一步進(jìn)行了體外功能研究。首先將該基因編碼成熟蛋白序列構(gòu)建到pET-30a(+)表達(dá)載體中，在大腸桿菌Escherichia coli中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行大量表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和層析、腸激酶酶解等步驟，得

9、到純化的CsupOBP8蛋白。然后以1-NPN為探針，利用熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)，測定了CsupOBP8對(duì)包括30種常見植物揮發(fā)物及3種性信息素組分在內(nèi)的不同氣味物質(zhì)的結(jié)合能力。結(jié)果表明，CsupOBP8與β-紫羅蘭酮、橙花叔醇、法尼醇、2-己酮等4種氣味物質(zhì)具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，其Ki值分別為4.9、13.1、14.0、15.0μmol·L-1;此外，對(duì)苯甲醛、庚醇、2，6-二叔丁基苯酚、雪松醇、苯乙酮等5種物質(zhì)也有一定的結(jié)合能力，其Ki值為

10、22.3-30.8μmol·L-1。分析認(rèn)為，CsupOBP8可能通過對(duì)這些氣味物質(zhì)的結(jié)合與運(yùn)輸，在二化螟幼蟲和成蟲對(duì)寄主植物的嗅覺中發(fā)揮作用。
　　4.褐飛虱CSP基因的克隆及序列分析
　　結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析并利用RACE技術(shù)，克隆了褐飛虱9個(gè)CSP基因的全長cDNA序列，分別命名為NlugCSP1-9。氨基酸序列分析表明，這9個(gè)CSP均含有4個(gè)保守性的半胱氨酸位點(diǎn)，為典型的CSP基因。不同NlugCSP序列之間的一致性變

11、化較大，從10％到77％。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，9個(gè)基因中只有NlugCSP5、NlugCSP7和NlugCSP8聚在同一組，其余則分散于不同組中，暗示褐飛虱不同CSP存在功能分化。
　　5.褐飛虱CSP基因的時(shí)間和組織表達(dá)動(dòng)態(tài)
　　利用qPCR技術(shù)，對(duì)褐飛虱9個(gè)NlugCSP基因在若蟲不同齡期以及成蟲不同組織的表達(dá)量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，隨褐飛虱發(fā)育期的不同，NlugCSP基因的表達(dá)量也有較大變化。 NlugCSP9主要在5齡若

12、蟲表達(dá)，NlugCSP5主要在長翅型成蟲中表達(dá)，NlugCSP8則在5齡若蟲以及長翅型成蟲中均有表達(dá)。對(duì)成蟲期不同組織的表達(dá)量分析表明，NlugCSP1在雄蟲腹部顯著高表達(dá);NlugCSP2、4、5、7在雌蟲翅中高表達(dá);NlugCSP3、6、8、9則在雄蟲足部高表達(dá)。進(jìn)一步分析看出，NlugCSP7在昆蟲各組織中的表達(dá)量顯著高于其它NlugCSPs，且在翅、足、觸角等化學(xué)組織中均有較高的表達(dá)，推測NlugCSP7可能參與了褐飛虱的化感過