松褐天牛氣味結(jié)合蛋白基因克隆與分析.pdf

1、松褐天牛Monochamus alternatus Hope為害松樹，影響植株正常生長(zhǎng)，同時(shí)是傳播松材線蟲病的國(guó)際檢疫性害蟲，給我國(guó)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。松褐天?；顒?dòng)具有隱蔽性，化學(xué)防治、物理防治和生物防治的單一使用難以在較短時(shí)間內(nèi)控制松褐天牛，因此，急需尋找一種環(huán)保高效措施防治松褐天牛。昆蟲嗅覺在其尋找寄主植物取食和產(chǎn)卵交配場(chǎng)所起到重要作用，萜烯類揮發(fā)物對(duì)松褐天牛有一定的引誘效果，但對(duì)于松褐天牛成蟲如何感知這些信息化學(xué)物質(zhì)的機(jī)制還不明確。

2、氣味結(jié)合蛋白(OBPs)在昆蟲嗅覺系統(tǒng)實(shí)行氣味感知和運(yùn)輸過程中起著極其重要的作用，但對(duì)于OBPs在昆蟲嗅覺中的功能還不明確。為此，本課題以松褐天牛為研究對(duì)象，在克隆了其觸角9條MaltOBPs基因的基礎(chǔ)上，分析MaltOBPs基因時(shí)空表達(dá)譜，測(cè)定MaltOBPs與寄主植物松樹揮發(fā)物的結(jié)合特性，并分析松褐天牛成蟲對(duì)氣味物質(zhì)的行為反應(yīng)，以期為闡明MaltOBPs在松褐天牛嗅覺感受中的功能奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　1.松褐天牛氣味結(jié)

3、合蛋白(MaltOBPs)基因克隆
　　克隆了松褐天牛9條MaltOBPs基因全長(zhǎng)，MaltOBP6、MaltOBP7、MaltOBP12、MaltOBP13、MaltOBP14、MaltOBP15、MaltOBP16、MaltOBP18、MaltOBP20。9條MaltOBPs基因分別編碼143、128、143、136、166、133、142、124、131個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)分別為KF977559、KF977560、

4、KF977565、KF977566、KF977567，KF977568、KF977569、KF977571、KF977573。通過氨基酸序列分析，5條OBPs基因MaltOBP6、MaltOBP13、MaltOBP14、MaltOBP15、MaltOBP16具有6個(gè)保守的半胱氨酸，屬于Classic OBPs;而MaltOBP7、MaltOBP12、MaltOBP18、MaltOBP20具有四個(gè)保守的半胱氨酸，屬于Minus-C OBP

5、s。
　　2.松褐天牛OBPs基因時(shí)空表達(dá)特性
　　通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了MaltOBP6、MaltOBP7、MaltOBP12、MaltOBP13、MaltOBP14、MaltOBP15、MaltOBP16、MaltOBP18、MaltOBP20等9條基因在不同時(shí)期、不同組織的表達(dá)情況。結(jié)果表明，9條MaltOBPs主要表達(dá)于觸角和腹末三節(jié)，也有基因高表達(dá)于足中，且在頭、翅也有一定的表達(dá)量;而松褐天牛9條MaltOB

6、Ps基因在觸角中表達(dá)量受交配狀態(tài)、性別、發(fā)育時(shí)期而呈現(xiàn)差異。
　　3.松褐天牛MaltOBP13表達(dá)純化及結(jié)合特性
　　構(gòu)建pET30a-MaltOBP13重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中試表達(dá)成功，主要表達(dá)于包涵體中，通過包涵體變性和復(fù)性獲得帶有部分雜蛋白的融合蛋白液，由Ni sepharose high performanc的1ml預(yù)裝柱純化和recombinant bovineenterokinase酶切，

7、獲得MaltOBP13純蛋白。
　　以1-NPN為熒光探針進(jìn)行熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，測(cè)定該蛋白與20種松樹揮發(fā)物在酸性(pH=5.0)和中性(pH=7.4)條件下的結(jié)合特性。結(jié)果表明，MaltOBP13在酸性條件下與松樹揮發(fā)物有較好的結(jié)合能力，在中性和酸性條件下與大部分單體物質(zhì)有較好的結(jié)合特性。
　　4.松褐天牛成蟲對(duì)氣味物質(zhì)的行為選擇
　　依據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有松樹揮發(fā)物單體，結(jié)合MaltOBP13在中性條件下與揮發(fā)物結(jié)合力的反