大螟氣味結(jié)合蛋白基因的克隆和功能分析.pdf

1、昆蟲在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，形成了以觸角為主的極為發(fā)達(dá)的嗅覺系統(tǒng)，藉此識(shí)別環(huán)境中大量的化學(xué)信息，從而做出相應(yīng)的生理和行為反應(yīng)，如尋找配偶、食物源、棲息和產(chǎn)卵場(chǎng)所、逃避天敵等。鱗翅目昆蟲為全變態(tài)昆蟲，其中蛾類昆蟲的成蟲為夜行性，需要更為靈敏的嗅覺系統(tǒng)，以適應(yīng)夜間對(duì)異性個(gè)體、寄主植物等的嗅覺定向。氣味結(jié)合蛋白(Odorantbindingprotein，OBP)是高濃度存在于昆蟲觸角感器腔內(nèi)的一類水溶性小分子蛋白，具有對(duì)進(jìn)入到觸角內(nèi)的脂溶性氣味

2、物質(zhì)進(jìn)行結(jié)合并運(yùn)送到感受神經(jīng)元受體部位的作用，因此被認(rèn)為是昆蟲嗅覺的第一個(gè)生化步驟。大螟（Sesamiainferens）屬鱗翅目、夜蛾科，自2000年以來，大螟逐漸上升為我國重要的水稻害蟲，基于嗅覺的行為調(diào)控技術(shù)在很多害蟲的防治中已經(jīng)得到應(yīng)用，深入研究OBP等嗅覺相關(guān)基因及其功能，對(duì)于開發(fā)高效的大螟行為調(diào)控技術(shù)具有重要意義。本研究利用大螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，從大螟中克隆了3個(gè)性信息素結(jié)合蛋白(Phero

3、monebindingprotein，PBP)基因和2個(gè)一般氣味結(jié)合蛋白(Generalodorantbindingprotein，GOBP)基因，測(cè)定了它們的組織表達(dá)譜，并利用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)初步探索了它們的生理功能。主要結(jié)果如下:
　　1、大螟OBP的基因克隆及序列分析
　　通過設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析并利用RACE技術(shù)，克隆了大螟3個(gè)PBP和2個(gè)GOBP基因的全長(zhǎng)cDNA序列。5個(gè)基因分別命名為SinfPBP1

4、、SinfPBP2、SinfPBP3、SinfGOBP1和SinfGOBP2，3個(gè)PBP的全長(zhǎng)cDNA序列的GenBank登錄號(hào)分別為JF927621、JN984058、JF927622、KC887506和KF150178。序列分析表明，所有OBP均具有典型OBP的序列特征，其中包括6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)。SinfPBP1、SinfPBP2、SinfPBP3、SinfGOBP1和SinfGOBP2的氨基酸序列與其它鱗翅目昆蟲，尤其是夜蛾

5、科昆蟲OBP具有很高的相似性，分別達(dá)94％、88％、85％、91％和87％。進(jìn)化樹分析顯示，這5個(gè)OBP分屬于PBP和GOBP兩個(gè)亞類，不同基因間的距離與昆蟲間的親緣關(guān)系一致。
　　2、大螟OBP基因在雌雄成蟲不同組織及不同日齡觸角的表達(dá)量
　　組織表達(dá)譜分析及雌雄間差異比較是了解OBP基因功能的重要途經(jīng)。為了明確SinfOBP基因的組織分布情況，首先利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了這5個(gè)基因在雌雄成蟲不同組織的表達(dá)量。結(jié)果表明，

6、5個(gè)OBP均主要觸角中表達(dá)，其他組織幾乎不表達(dá)。進(jìn)一步通過qPCR技術(shù)，定量比較了5個(gè)OBP在雌雄觸角中不同日齡的表達(dá)動(dòng)態(tài)及性別差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個(gè)SinfOBP在雌雄觸角中的表達(dá)量均在4日齡達(dá)到最高值;雌雄比較而言，PBP1和PBP2在雄蟲中的表達(dá)量顯著高于雌蟲，而PBP3則在雌蟲中的表達(dá)量略高于雄蟲，以4日齡為例3個(gè)PBP表達(dá)量的雄雌比分別為11∶1、6∶1和1∶1.6。2個(gè)GOBP基因的表達(dá)量在雌雄間均無顯著差異。
　　3、

7、大螟PBP的體外表達(dá)及純化
　　為了研究PBP的嗅覺功能，進(jìn)一步對(duì)這大螟3個(gè)PBP基因進(jìn)行了體外大量表達(dá)和純化。首先將3個(gè)基因構(gòu)建到pGEX-4T-1(PBP1、PBP2)和pET-30a(+)(PBP3)表達(dá)載體中，然后在大腸桿菌Escherichiacoli中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析表明，pGEX/SinfPBP1、pGEX/SinfPBP2和pET/SinfPBP3分別在約42kDa、42kDa和2

8、2kDa處有一明顯加粗條帶，和預(yù)期大小一致;3個(gè)外源表達(dá)的PBP中，PBP1和PBP2以可溶性形式存在，而PBP3以包涵體形式存在。重組蛋白經(jīng)親和層析、酶切表達(dá)標(biāo)簽等步驟純化后，冷凍干燥用于后續(xù)功能分析。
　　4、大螟PBP的配體結(jié)合能力分析
　　利用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定了3個(gè)SinfPBP對(duì)包括大螟性信息素及水稻揮發(fā)物在內(nèi)共30種氣味物質(zhì)的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)SinfPBP1對(duì)3個(gè)性信息素組分Z9-16∶Ald、Z9-16∶OH

9、和Z9-16∶Ac都有很強(qiáng)的結(jié)合能力，Ki值分別為0.72、1.00和1.60;SinfPBP2對(duì)醇類和醛類性信息素組分及其類似物也表現(xiàn)出很強(qiáng)的結(jié)合能力，Ki值分別為0.78和1.71，但對(duì)酯類組分卻沒有結(jié)合能力;SinfPBP3對(duì)大螟的3種性信息素組分均無明顯結(jié)合能力。與性信息素組分相比較，3個(gè)PBP與植物揮發(fā)物的結(jié)合能力普遍較差。綜合分析認(rèn)為，在大螟雄蛾對(duì)雌雄性信息素的感受中，PBP1起主要作用，PBP2具有識(shí)別醇類和醛類組分的功能