花生?；d體蛋白基因的克隆與功能分析.pdf

1、?；d體蛋白(acyl carrier protein，ACP)是一類具有保守的絲氨酸殘基的小分子量的酸性蛋白質。在脂肪酸合成過程中，ACP攜帶?；溚瓿煽s合、還原和脫氫等酶促反應。它還是不同長度酰基鏈的脂肪酸的?；鵄CP去飽和反應和質體類?；D移酶作用的輔助因子。植物貯藏脂肪酸中不飽和脂肪酸的含量、組成以及它們在總脂肪酸中所占的比例，與ACP異構體的種類及差異表達有密切關系。 已有研究表明，在擬南芥中表達由35S啟動子驅動的帶

2、有其上游400bp調控區(qū)ACP1基因，引起轉基因植株葉組織中ACP1基因的表達量增加了3—8倍，而在種子中沒有明顯的變化。同時，也使葉組織中脂肪酸組成發(fā)生了變化，16：3的含量明顯減少，而相應的增加了亞麻酸18：3的含量，但總脂肪酸含量不變。 本研究在克隆獲得花生AhACP1-1基因和AhACP1—2基因的基礎上，對這兩個基因在根、莖、葉、花和種子表達模式進行了分析；并在擬南芥、煙草和花生中利用過量表達和反義抑制表達策略驗證這兩

3、個基因的功能。主要研究結果如下： 1.用半定量RT—PCR方法分析AhACP1-1和AhACP1—2在根、莖、葉、花和種子中表達模式，發(fā)現(xiàn)AhACP1-1在莖中幾乎不表達，在種子的表達量最高，在根、葉和花中表達量相近；AhA CP1—2各個部位均有表達，且表達量在種子和葉片中較高，在根和花中次之，莖中最弱。 2.以pROKII為原始載體，將AhA CP1-1和AhACP1—2這兩個基因編碼區(qū)及其上游約54 bp和下游約2

4、0 bp正向和反向插入載體的相應位點，由此獲得4個植物表達載體。其中，上游約54 bp包括保守的七核苷酸基序“CTCCGTC”和“CT—rich”區(qū)。 3.擬南芥、煙草和花生的遺傳轉化 (1)在擬南芥中過量表達和抑制表達花生的AhACP1-1基因和AhACP1—2基因，獲得部分卡那抗性擬南芥，經篩選和PCR檢測分別獲得轉基因T1代各10株。 (2)在煙草SR1中過量表達和抑制表達花生的AhACP1-1基因和AhA

5、CP1—2基因，獲得25株卡那抗性煙草植株，經分子檢測均為轉基因陽性植株，其中AhACP1-1基因過量表達和反義抑制各6棵，AhACP1—2基因過量表達7棵，反義抑制6棵。與野生煙草相比，在絕大多數(shù)獨立的轉基因株系中外源基因的表達量明顯提高。 (3)以魯花14中的胚小葉為外植體，建立了高效的遺傳轉化體系；并通過農桿菌介導的轉化法過量表達和抑制表達花生的AhACP1-1基因和AhACP1—2基因，共獲得15株卡那抗性花生植株，PC

6、R檢測結果均為陽性植株，其中過量表達獲得5株，反義抑制表達獲得10株。 4.轉基因煙草植株中AhA CPl-1基因和AhACPl—2基因功能驗證 用氣相色譜法檢測部分轉基因煙草植株葉片脂肪酸含量，結果顯示有兩株轉基因植株葉片不飽和脂肪酸含量比野生煙草明顯提高；用分光光度法對經過低溫處理的轉基因植株葉片中的丙二醛、游離脯氨酸和可溶性糖的含量進行測定，結果顯示，在低溫脅迫下，與對照煙草相比，轉基因植株葉片中游離脯氨酸和可溶性

7、糖的含量具有不同程度提高，而丙二醛含量則有所降低。 綜上所述，本研究優(yōu)化了花生再生和遺傳轉化體系；通過基因工程手段在不同物種中過量表達和抑制表達了花生的AhACP1-1基因和AhACP1—2基因；轉基因功能分析表明，在煙草中組成型表達這兩個基因可以改變轉基因植株葉片脂肪酸組成，并且葉片中不飽和脂肪酸含量增加可能提高轉基因植株的抗寒性；下一步我們將在轉基因擬南芥和花生中進一步分析這兩個基因的功能，并在花生種子中過量表達這兩個基因，