番茄谷氧還蛋白基因SlGRX1的克隆與功能分析.pdf

1、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)是植物體內(nèi)正常代謝的信號小分子,在植物生長發(fā)育和抗逆反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用。但是,過多的活性氧積累會(huì)嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育,造成氧化脅迫。谷氧還蛋白是一類小分子的氧化還原蛋白,能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的氧化還原狀態(tài),從而維持蛋白質(zhì)的活性,在植物抗氧化脅迫及生長發(fā)育反應(yīng)中具有重要作用。近年來,越來越多的谷氧還蛋白基因被克隆,其分子功能被闡明。本研究從番茄中克隆得到了一個(gè)新的CGF

2、S類谷氧還蛋白基因,并在番茄中利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)以及在擬南芥中利用超量表達(dá)技術(shù)研究了其在植物抗氧化、干旱及高鹽脅迫中的作用。
　　 根據(jù)已發(fā)表的水稻和擬南芥的CGFS類谷氧還蛋白基因的序列信息,采用同源克隆和電子克隆的方法,從番茄中分離得到了一個(gè)新的CGFS類谷氧還蛋白基因,命名為。SlGRX1。該基因是從番茄中分離得到的第一個(gè)谷氧還蛋白基因,編碼的蛋白質(zhì)有292個(gè)氨基酸,其結(jié)構(gòu)具有谷氧還蛋白基因家族保守的結(jié)構(gòu)域和典型的

3、CGFS催化位點(diǎn)。
　　 通過Southern雜交分析表明,SlGRX1在番茄在基因組中以單拷貝的形式存在。采用Real time PCR的方法分析了.SlGRX1基因在番茄中的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)該基因能夠在番茄的根、莖、葉片和花瓣中表達(dá),其中葉片中的表達(dá)量最高,根和莖中的表達(dá)量相對較低,同時(shí)也證明該基因能夠受外界逆境條件如氧化、干旱和高鹽的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 構(gòu)建了SlGRX1和GFP的融合植物表達(dá)載體,將SlGRX1融合到

4、GFP蛋白的C端以及N端,采用農(nóng)桿菌浸潤法,在本氏煙葉片的表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)重組蛋白,通過激光共聚焦顯微鏡觀察SlGRX1蛋白的亞細(xì)胞定位,結(jié)果表明,SlGRX1能夠定位在植物細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。
　　 構(gòu)建了基于雙生病毒衛(wèi)星DNAp的SlGRX1的沉默載體,并將該載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中,以中國番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl Chinavirus,TYLCCNV)為輔助病毒,在番茄中沉

5、默了SlGRX1基因,以接種TYLCCNV和空載體的番茄作為對照。SlGRX1基因沉默番茄與對照相比對氧化和鹽脅迫更為敏感,主要表現(xiàn)為葉綠素降解速度加快;在干旱脅迫下,SlGRX1基因沉默番茄與對照相比則更容易出現(xiàn)黃化和萎蔫的癥狀,葉片內(nèi)的相對含水量有明顯的下降。這些結(jié)果表明,SlGRX1基因在植物的抗氧化、干旱和高鹽反應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用。
　　 將SlGRX1基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體pBin438中,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸蘸

6、法對模式植物擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,獲得了2個(gè)單拷貝的純合T3代轉(zhuǎn)基因株系Y1、Y2,同時(shí)將pBin438空載體也轉(zhuǎn)化到擬南芥中作為研究的對照。通過分析株系Y1、Y2與對照在氧化、干旱和高鹽脅迫下的表型,進(jìn)一步明確了SlGRX1基因的功能,無論擬南芥在離體生長條件下還是土壤生長條件下,SlGRX1基因超量表達(dá)的株系Y1、Y2對氧化、干旱和高鹽的抗性都明顯高于對照,說明超量表達(dá)SlGRX1基因能夠提高植物對上述逆境的抗性。
　　 為了