玉米泛素延伸蛋白ZmERD16的基因克隆與功能分析.pdf

1、玉米是重要的糧、經(jīng)、飼兼用作物。在世界糧食作物中其種植面積和總產(chǎn)鼙已超過(guò)水稻和小麥，處于所有作物之首。低溫、干旱、鹽堿等逆境條件嚴(yán)重影響玉米的質(zhì)量和產(chǎn)量，其中水分脅迫是影響玉米產(chǎn)量最主要非生物脅迫因素之一。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，許多受水分脅迫影響的植物基因在響應(yīng)多種脅迫中發(fā)揮著重要作用。發(fā)掘抗旱相關(guān)基因及研究抗旱基因在植物逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的調(diào)控作用。對(duì)于提高水分利用率，節(jié)省水資源，減少干旱危害，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　

2、 ERD（early responsive to dehydration）基因是一類(lèi)對(duì)水分脅迫做出快速應(yīng)答的基因。Kiyosue等最先在擬南芥水分脅迫1小時(shí)后分離到16個(gè)ERD基因全長(zhǎng)cDNA序列，其中包括一個(gè)泛素延伸蛋白AtERD16。泛素延伸蛋白可通過(guò)降解異常的蛋白而對(duì)植物細(xì)胞起保護(hù)作用。本研究以抗旱玉米自交系CN165為試材，克隆玉米中與擬南芥AtERD16基因序列同源的泛素延伸蛋白基因，命名為ZmERD16。通過(guò)生物信息學(xué)手段預(yù)

3、測(cè)該基因結(jié)構(gòu)和序列特點(diǎn)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)ZmERD16進(jìn)行表達(dá)譜分析；通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥對(duì)其進(jìn)行功能的初步研究。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.ZmERD16基因的克隆應(yīng)用同源克隆技術(shù)從抗旱玉米自交系CN165中得到1個(gè)泛素延伸蛋白序列，與AtERD16基因序列高度相似，命名為ZmERD16。同時(shí)利用PCR方法得到了ZmERD16的基因組DNA序列3252bp和其上游啟動(dòng)子序列2190bp。
　

4、　 2.ZmERD16的序列分析在線(xiàn)分析表明ZmERD16的開(kāi)放閱讀框?yàn)?90bp，編碼129個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)pI為9.94，分子量為14.7582KD。ZmERD16蛋白包含1個(gè)泛素單體蛋白，其后融合了一個(gè)53個(gè)氨基酸的核糖體多肽，屬于ubiquitin/L40泛素延伸蛋白亞族。ZmERD16具有由4個(gè)外顯子3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成的基因組結(jié)構(gòu)。
　　 3.同源性比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析ZmERD16蛋白與其他真核生物中的ubiquitin/

5、L40泛素延伸蛋白序列具有高度同源性。聚類(lèi)分析將所聚類(lèi)的植物分為單子葉植物、雙子葉植物和綠藻3類(lèi)，此結(jié)果與生物進(jìn)化有高度的相關(guān)性。
　　 4.亞細(xì)胞定何利用綠色熒光蛋白（GFP）融合蛋白技術(shù)來(lái)進(jìn)行洋蔥表皮實(shí)驗(yàn)，將ZmERDl6定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。
　　 5.順式作用元件分析該基因的啟動(dòng)子區(qū)域具有多個(gè)光應(yīng)答、發(fā)育、激素、干旱、病害防御、真菌等脅迫應(yīng)答元件。
　　 6.ZmERD16的表達(dá)譜分析利用實(shí)時(shí)熒光定量P

6、CR對(duì)ZmERD16的組織特異性和在不同脅迫條件下的表達(dá)譜進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ZmERD16在正常生長(zhǎng)條件下玉米的雌穗、雄穗、幼胚、花絲、穗位葉、幼葉和根中均具有一定量的積累：ZmERD16受鹽、脫水、PEG、低溫、高溫、茉莉酸甲酯和水楊酸等多種脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，而不受ABA和類(lèi)生長(zhǎng)素處理誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 7.ZmERD16基因轉(zhuǎn)化野生型擬南芥ZmERD16過(guò)表達(dá)影響了擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育，轉(zhuǎn)基因株系的幼苗比野生型的幼苗明顯要小，且轉(zhuǎn)基