植物泛素延伸蛋白和鈣調(diào)蛋白基因的抗病調(diào)控功能分析.pdf

1、鈣調(diào)蛋白(Calmodulin，CaM)是Ca2+信號(hào)途徑主要受體之一，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及抗逆境起重要調(diào)控作用，但在抗病性中的作用研究較少。泛素延伸蛋白(Ubiquitin extension protein, UEP)是泛素單體與核糖體蛋白的融合蛋白，在泛素羧端水解酶(Ubiquitin carboxyl terminal hydrolase)作用下形成泛素單體和核糖體蛋白。雖然泛素-26S蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-26S p

2、roteasome system，UPS)在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗病抗逆等方面有著重要的作用，但UEP對(duì)植物抗病性的調(diào)控作用還不明確。本研究以UEP和CaM為切入點(diǎn)，分析UEP和CaM在植物抗病過(guò)程中的調(diào)控作用，從而初步明確UEP與Ca2+信號(hào)途徑在協(xié)同調(diào)控植物抗病反應(yīng)的分子機(jī)制。獲得主要結(jié)果如下:
　　(1)獲得了6株UEP-RNAi轉(zhuǎn)基因煙草株系，明確了UEP基因沉默對(duì)煙草葉片發(fā)育的影響。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了6個(gè)UEP-

3、RNAi轉(zhuǎn)基因煙草株系。對(duì)UEP-RNAi植株表型觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，除UEP-6株系外，其余5個(gè)株系植株葉片均表現(xiàn)花葉和皺縮癥狀，皺縮部位呈現(xiàn)水漬狀凹陷小斑點(diǎn)。這些癥狀隨植物的生長(zhǎng)發(fā)育而加重。UEP-RNAi植株的發(fā)育與繁殖與野生型沒(méi)有明顯差異，均能正常開(kāi)花結(jié)實(shí)。經(jīng)qRT-PCR測(cè)定，6個(gè)株系中株平均UEP沉默效率為65％-80％。同一UEP-RNAi植株中不同表型葉片UEP基因沉默效率有所不同，無(wú)表型葉片中最高，達(dá)90％左右;花葉表型葉片中為

4、80％左右;而水漬狀斑點(diǎn)表型葉片中相對(duì)較低，為60％左右。
　　DAB和臺(tái)盼藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)，僅有水漬狀斑點(diǎn)表型葉片能被染色，表明水潰狀區(qū)域葉肉組織有壞死產(chǎn)生且伴隨活性氧(Reactive oxidative species，ROS)的出現(xiàn)。掃描電鏡分析表明，水漬狀壞死斑點(diǎn)表型葉片表皮組織不完整，柵欄組織裸露在外，而其余兩種表型葉片表皮細(xì)胞與野生型無(wú)差別;三種不同表型葉片中表皮細(xì)胞角質(zhì)紋理與保衛(wèi)細(xì)胞紋絡(luò)均不相同。透射電鏡研究表明，三種不

5、同表型葉片葉綠體形態(tài)和結(jié)構(gòu)也存在差異，野生型與水漬狀斑點(diǎn)表型葉片中葉綠體有淀粉粒填充，而無(wú)表型與花葉表型葉片葉綠體內(nèi)均無(wú)淀粉粒。qRT-PCR測(cè)定表明，UEP-RNAi植株中三種表型葉片過(guò)敏性壞死反應(yīng)(Hypersensitive reaction，HR)標(biāo)志基因以及PR基因表達(dá)都有所上升。
　　(2)明確了UEP基因?qū)Χ喾N病害起不同調(diào)控作用。UEP的沉默減弱煙草植株對(duì)Xoo介導(dǎo)的HR以及對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的抗性，但增強(qiáng)植株對(duì)核盤(pán)菌、瓜果

6、腐霉以及CMV和TMV病毒的抗性。為明確UEP調(diào)控抗病性的作用機(jī)理，對(duì)UEP-RNAi植株的基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，UEP的沉默導(dǎo)致鈣調(diào)蛋白和鈣依賴(lài)性蛋白激酶等Ca2+信號(hào)途徑基因、WRKY轉(zhuǎn)錄因子以及茉莉酸途徑相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào)，而植株體內(nèi)多聚泛素基因、蛋白質(zhì)水解途徑、乙烯途徑相關(guān)基因等表達(dá)量下調(diào)，表明UEP可通過(guò)與Ca2+信號(hào)途徑、轉(zhuǎn)錄因子或是多種激素途徑協(xié)同作用進(jìn)而調(diào)控植物的抗病性。
　　(3)在基因組水平鑒定了茄科

7、植物鈣調(diào)蛋白(CaM)基因家族，并采用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)技術(shù)分析明確番茄CaM基因?qū)Χ喾N病害抗性起重要調(diào)控作用。采用生物信息學(xué)技術(shù)分別鑒定獲得6個(gè)番茄(Solanum lycopersicum)、7個(gè)本氏煙(Nicotiana benthamiana)和4個(gè)馬鈴薯(Solanumtuberosum)全長(zhǎng)CaM序列。發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因編碼同一CaM蛋白的現(xiàn)象，如SlCaM3/

8、4/、StCaM2/、NbCaM1/2/3/4以及NbCaM5/6均分別編碼氨基酸序列一致的蛋白。此外，發(fā)現(xiàn)茄科CaM在進(jìn)化中形成了一個(gè)新的組別，其成員基因含有3個(gè)內(nèi)含子，而已知植物CaM均只含一個(gè)內(nèi)含子。
　　SlCaM啟動(dòng)子順式作用元件組成分析及不同刺激處理下SlCaM基因表達(dá)分析結(jié)果表明，SlCaM對(duì)非生物與生物脅迫的調(diào)控方式各有不同。此外，采用VIGS技術(shù)分析了SlCaM2和SlCaM6沉默的抗病調(diào)控作用。結(jié)果表明，這些S