小麥擴(kuò)展蛋白基因TaEXPB23的功能分析.pdf

1、小麥(Triticum aestivum L.)是僅次于水稻的第二大糧食作物。小麥在生長(zhǎng)過程中經(jīng)常遭受來自環(huán)境的危害而使生長(zhǎng)受到抑制，從而導(dǎo)致產(chǎn)量降低。擴(kuò)展蛋白是一種能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞壁延伸和植物生長(zhǎng)的細(xì)胞壁蛋白，普遍存在于正在生長(zhǎng)的植物組織和果實(shí)中。它的發(fā)現(xiàn)始自1989年美國(guó)賓夕法尼亞州立大學(xué)Cosgrove等人對(duì)黃瓜下胚軸細(xì)胞延伸性的研究，自此以后開始了對(duì)擴(kuò)展蛋白的研究，近幾年研究結(jié)果逐漸豐富。業(yè)已證明，擴(kuò)展蛋白參與多種植物生長(zhǎng)發(fā)育過程以

2、及逆境適應(yīng)性響應(yīng)。
　　本實(shí)驗(yàn)室之前克隆了小麥擴(kuò)展蛋白基因TaEXP B23，并獲得了過量表達(dá)該基因的多個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotiana tabacum L.）株系。本研究的目標(biāo)是揭示該基因在植物逆境適應(yīng)中的作用并分析其生理機(jī)制。首先克隆了TaEXP B23的啟動(dòng)子區(qū)域，對(duì)基因的時(shí)空表達(dá)、激素響應(yīng)和逆境響應(yīng)表達(dá)模式進(jìn)行了分析;其次利用過表達(dá)TaEXPB23的轉(zhuǎn)基因煙草，研究了該基因在植物耐旱、耐鹽、耐高溫以及磷脅迫適應(yīng)中的作用，并

3、進(jìn)一步探討了其生理機(jī)制，主要結(jié)論如下:
　　(1)將TaEXPB23∷GFP融合蛋白在洋蔥表皮中瞬時(shí)表達(dá)，證實(shí)TaEXPB23蛋白定位于細(xì)胞壁。qRT-PCR檢測(cè)TaEXPB23在小麥胚芽鞘中的表達(dá)水平，證實(shí)其表達(dá)水平與小麥胚芽鞘的生長(zhǎng)密切相關(guān)。
　　(2)利用TAIL-PCR克隆得到了TaEXPB23啟動(dòng)子區(qū)域996bp的片段(GenBank ID:HQ391898)，用PlantCARE和PLACE功能預(yù)測(cè)軟件對(duì)其進(jìn)行了

4、分析，表明該啟動(dòng)子區(qū)域含有多種光響應(yīng)元件、組織特異表達(dá)元件、多種激素（水楊酸、茉莉酸甲酯）響應(yīng)元件和逆境（干旱、ABA和高溫）響應(yīng)元件;構(gòu)建ProTaEXPB23∷GUS表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草，證實(shí)該基因主要在煙草的莖部和根部表達(dá)。
　　(3) qRT-PCR檢測(cè)了小麥中TaEXPB23在不同的外源激素和非生物脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果表明:TaEXPB23受多種外源激素調(diào)節(jié)，GA3、ET和NAA顯著抑制了TaEXPB23的表達(dá)水平，而M

5、eJA則上調(diào)了該基因的表達(dá)，IAA處理先抑制隨后誘導(dǎo)了TaEXPB23的表達(dá)，而ABA則在后期稍微抑制了TaEXPB23的表達(dá);此外，鹽脅迫能夠明顯提高TaEXPB23的mRNA表達(dá)水平，而高溫則抑制該基因的表達(dá)。
　　(4)過表達(dá)TaEXPB23煙草對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)性研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱和鹽脅迫的耐性顯著提高，而對(duì)高溫的耐性降低。具體表現(xiàn)在:鹽脅迫條件下，過表達(dá)TaEXPB23煙草能維持較好的生長(zhǎng)表型，主根較長(zhǎng)，存活率

6、較高，耐鹽性較野生型強(qiáng)。生理指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草能夠維持較低的滲透勢(shì)和相對(duì)較高的保水能力，從而確保植物能從土壤中吸收并保持水分。干旱脅迫下，過表達(dá)TaEXPB23煙草的生長(zhǎng)表型和植株存活率顯著高于野生型煙草，表明轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性較野生型強(qiáng)。但是，高溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草的主根長(zhǎng)度受到了顯著抑制，其存活率和保水能力與野生型煙草相比也明顯降低，耐熱性較野生型差。
　　(5)用小麥作實(shí)驗(yàn)材料，檢測(cè)了多個(gè)擴(kuò)展蛋白基因?qū)ΦV質(zhì)元素磷的響應(yīng)

7、模式。結(jié)果顯示，過量磷和低磷條件下，小麥胚芽鞘生長(zhǎng)區(qū)的細(xì)胞長(zhǎng)度或?qū)挾扰c正常條件下相比有顯著提高;過磷和低磷處理均能提高擴(kuò)展蛋白的總活性。qRT-PCR的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個(gè)α-擴(kuò)展蛋白和8個(gè)β-擴(kuò)展蛋白的表達(dá)均受磷水平的調(diào)節(jié)。過量磷條件下，TaEXPB23的mRNA水平顯著提高。
　　(6)對(duì)過表達(dá)TaEXPb23的轉(zhuǎn)基因煙草的磷適應(yīng)能力進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)其在過磷和低磷條件下的磷適應(yīng)能力與野生型煙草相比均有顯著提高。具體表現(xiàn)在:其生物量能

8、夠維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平，側(cè)根數(shù)目較多，根系形態(tài)較好，光合參數(shù)受影響程度較野生型小。
　　(7)檢測(cè)了過表達(dá)TaEXPB23煙草的抗氧化脅迫能力。TaEXPB23的表達(dá)水平受MV強(qiáng)烈誘導(dǎo)，過表達(dá)TaEXPb23煙草對(duì)MV引起的氧化脅迫的抗性明顯增強(qiáng)。氧化脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草的葉片生長(zhǎng)表型好于野生型煙草，植株鮮重、主根長(zhǎng)度和葉綠素含量都明顯高于野生型煙草，MDA含量低于野生型煙草。
　　(8)過表達(dá)TaEXPB23煙草抗氧化脅迫能

9、力的提高與植物細(xì)胞壁鍵連的過氧化物酶密切相關(guān)。轉(zhuǎn)基因煙草的細(xì)胞壁鍵連過氧化物酶顯著高于野生型煙草，擴(kuò)展蛋白抗體孵育轉(zhuǎn)基因煙草葉片能部分抑制其增強(qiáng)的抗氧化能力。用擬南芥(Arabidopsis thaliana L.)擴(kuò)展蛋白基因突變體atexpb2進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果，擬南芥突變體atexpb2的細(xì)胞壁鍵連過氧化物酶活性與Col-0野生型相比明顯降低，抗氧化脅迫也顯著降低。氧化脅迫條件下，atexpb2的葉綠素含量和萌發(fā)率與Col-0相