小麥細(xì)胞壁蛋白expansin基因的分離及其功能分析.pdf

1、小麥?zhǔn)鞘澜缧缘闹匾Z食作物，在我國(guó)是僅次于水稻的第二大糧食作物，其生長(zhǎng)和產(chǎn)量直接關(guān)系到人類食物的供應(yīng)。但是，小麥抗旱分子機(jī)制研究相對(duì)滯后。研究小麥生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控對(duì)于提高小麥產(chǎn)量具有重要意義。植物細(xì)胞的生長(zhǎng)與細(xì)胞壁的擴(kuò)張有關(guān)，對(duì)細(xì)胞壁擴(kuò)張機(jī)制進(jìn)行研究對(duì)于調(diào)控植物生長(zhǎng)至關(guān)重要。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，膨脹素蛋白在細(xì)胞壁擴(kuò)張過(guò)程中起著重要作用。本研究從小麥胚芽鞘中獲得了膨脹素基因全長(zhǎng)，命名為T(mén)ri-EXPB1(Triticumaesitivumβ-EXPA

2、NS1N1)。構(gòu)建了真核表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，獲得了轉(zhuǎn)基因植株；構(gòu)建了原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)Tri-EXPB1膨脹素蛋白，免疫家兔制備了抗體；以小麥胚芽鞘為材料，通過(guò)PCR、RT-PCR技術(shù)，研究了Tri-EXPB1的表達(dá)特性以及對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)；以轉(zhuǎn)基因煙草為材料，初步研究了Tri-EXPB1基因的生物學(xué)功能。主要結(jié)果如下： 根據(jù)已知的膨脹素序列設(shè)計(jì)兼并引物，利用RT-PCR技術(shù)和3’-、5'-RACE技

3、術(shù)，從小麥胚芽鞘中分離了Tri-EXPB1基因全長(zhǎng)cDNA，命名為T(mén)ri-EXPB1，序列比較發(fā)現(xiàn)Tri-EXPB1與GenBank中注冊(cè)的β-膨脹素基因具有高度的同源性；氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，推斷的Tri-EXPB1蛋白氨基酸序列中含有β-膨脹素家族蛋白的所有特征，屬于β-膨脹素基因家族中的一員。 為了研究膨脹素基因Tri-EXPB1的功能，構(gòu)建了pBI121XB1S表達(dá)載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化煙草，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。

4、 取小麥萌發(fā)期的胚芽鞘、根系和真葉等提取RNA，通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)了Tri-EXPB1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Tri-EXPB1基因在小麥根、真葉和胚芽鞘中均有表達(dá)，在胚芽鞘中表達(dá)水平高，在根中和真葉中表達(dá)水平較低。在小麥萌發(fā)期的不同時(shí)間取胚芽鞘提取RNA，RT-PCR法檢測(cè)胚芽鞘不同生長(zhǎng)時(shí)間Tri-EXPB1基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tri-EXPB1mRNA表達(dá)量與小麥胚芽鞘生長(zhǎng)過(guò)程關(guān)系緊密，基因的表達(dá)周期與胚芽鞘的生長(zhǎng)周

5、期相吻合。由于小麥胚芽鞘的生長(zhǎng)主要是細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的結(jié)果，沒(méi)有細(xì)胞分裂過(guò)程，推測(cè)Tri-EXPB1基因在調(diào)控細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要作用。 對(duì)萌發(fā)期小麥幼苗進(jìn)行水分脅迫處理，取根、真葉和胚芽鞘檢測(cè)Tri-EXPB1mRNA表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水分脅迫誘導(dǎo)了Tri-EXPB1mRNA表達(dá)。在小麥胚芽鞘伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的不同時(shí)間取樣檢測(cè)Tri-EXPB1mRNA表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)水分脅迫對(duì)胚芽鞘的生長(zhǎng)抑制，結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，水分脅迫誘導(dǎo)了胚芽鞘中Tri

6、-EXPB1mRNA表達(dá)，且表達(dá)周期與胚芽鞘的生長(zhǎng)周期相一致。因此，推測(cè)水分脅迫誘導(dǎo)Tri-EXPB1基因表達(dá)是小麥胚芽鞘對(duì)水分脅迫的一種適應(yīng)方式。 對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的研究觀察發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Tri-EXPB1基因明顯影響了煙草的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。促進(jìn)了煙草生育前期的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，導(dǎo)致煙草開(kāi)花期提前，縮短了煙草的生命周期，促進(jìn)了早熟；誘導(dǎo)了地上部分枝和地下側(cè)根的形成。這些結(jié)果表明，來(lái)源于小麥胚芽鞘的β-膨脹素基因Tri-EXPB1明顯影響了雙子

7、葉植物煙草的生長(zhǎng)和發(fā)育。過(guò)去一般認(rèn)為，β-膨脹素在單子葉植物中居多，與單子葉植物的生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系密切，對(duì)雙子葉植物生長(zhǎng)發(fā)育影響較小。本研究的發(fā)現(xiàn)與前人的觀點(diǎn)不太一致。 對(duì)轉(zhuǎn)β-膨脹素Tri-EXPB1基因煙草的抗旱性進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因煙草萌發(fā)率高，苗期生長(zhǎng)大大快于野生型，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性增強(qiáng)。 構(gòu)建了原核表達(dá)載體，利用大腸桿菌特異性地表達(dá)Tri-EXPB1蛋白，免疫家兔，制備了抗體，效價(jià)檢測(cè)證