綠僵菌細(xì)胞壁合成相關(guān)基因MaFKS和MaChsⅦ的克隆及功能分析.pdf

1、綠僵菌（Metarhizium acridum）作為重要的昆蟲病原真菌之一是控制自然界害蟲種群數(shù)量的其中一個(gè)重要因素。它具有主動(dòng)穿透昆蟲體壁、致病過程復(fù)雜不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，在日益受到人們重視的生物防控上具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。然而它也具有一定的缺點(diǎn)，如架貨期短、容易受到環(huán)境條件的影響、成本高等。真菌的細(xì)胞壁可以根據(jù)真菌的整個(gè)生活周期和外界環(huán)境的變化而不斷的改變，并且是真菌和環(huán)境接觸的媒介，在保護(hù)細(xì)胞免受外界有害環(huán)境的損害以及真菌的整個(gè)生活

2、周期中起重要作用。然而，目前對(duì)昆蟲病原真菌細(xì)胞壁的研究還較少。
　　本研究以綠僵菌為實(shí)驗(yàn)材料，在已知基因組序列的基礎(chǔ)上，克隆了β-1,3-葡聚糖合成酶基因MaFKS和絲狀真菌特有的VII類幾丁質(zhì)合成酶基因MaChsVII，并采用基因干擾和基因敲除技術(shù)對(duì)它們的生物學(xué)功能進(jìn)行了分析。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1、MaFKS的克隆與功能分析
　　1.1、MaFKS的克隆及序列分析
　　我們根據(jù)已知的基因組DN

3、A序列設(shè)計(jì)引物克隆得到β-1,3-葡聚糖合成酶基因命名為MaFKS，基因登錄號(hào)為HQ441252。該序列開放閱讀框?yàn)?820bp，編碼一個(gè)1938個(gè)氨基酸的蛋白。使用在線工具預(yù)測(cè)該蛋白分子量為221.7kDa，等電點(diǎn)為7.94。預(yù)測(cè)MaFKS蛋白含有16次跨膜區(qū)域，與其他絲狀真菌中葡聚糖合成酶同源性較高。與基因組DNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，MaFKS基因含有兩個(gè)內(nèi)含子，分別在N端（177-238bp）和C端（5539bp-5600bp）。

4、>　　1.2、利用RNAi技術(shù)對(duì)MaFKS基因的功能進(jìn)行分析
　　為研究MaFKS基因的功能我們構(gòu)建了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的干擾載體（pPK2-pB-MaFKS-RNAi），采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化綠僵菌后，獲得5個(gè)干擾轉(zhuǎn)化菌株。采用定量RT-PCR的方法檢測(cè)了干擾菌株中MaFKS基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，不同的干擾菌株的干擾效率在40％-64.2%之間。
　　1.3、MaFKS基因與細(xì)胞壁的完整性相關(guān)
　　我們

5、分析了MaFKS基因干擾菌株在含有不同細(xì)胞壁干擾劑的培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)與野生菌株相比，干擾轉(zhuǎn)化菌株在含有剛果紅、熒光增白劑或SDS的PDA平板上的菌落形態(tài)明顯不同。我們近一步在顯微鏡下觀察了干擾菌株與野生菌株菌絲生長(zhǎng)的差別。觀察發(fā)現(xiàn)，在含有CR、CFW的PDA平板上可觀察到野生菌株有大量的分支的氣生菌絲。相反，干擾轉(zhuǎn)化菌株僅有少量的沒有分支或只有少數(shù)分支的氣生菌絲。在液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化菌株的大部分菌絲元素與野生型沒有差異，但在CR

6、存在的條件下菌絲的尖端或內(nèi)部隔室出現(xiàn)膨脹。
　　1.4、MaFKS基因與綠僵菌高滲透壓的耐受性相關(guān)
　　在含有KCl的PDA平板上，干擾轉(zhuǎn)化菌株的基內(nèi)菌絲比野生型明顯減少。并且轉(zhuǎn)化菌株的的菌落表面光滑且呈黃褐色，而野生菌株的菌落表面則褶皺且變綠。干擾轉(zhuǎn)化菌株在含有山梨醇或甘露醇的PDA平板上，與野生型相比轉(zhuǎn)化菌株只有稀疏的氣生菌絲。這說明MaFKS影響綠僵菌對(duì)高滲透壓的耐受性。
　　1.5、干擾MaFKS基因后綠僵菌的

7、產(chǎn)孢量降低
　　測(cè)定干擾轉(zhuǎn)化菌株和野生菌株在PDA平板和含有CR、CFW、SDS、KCl、山梨醇和甘露醇的PDA平板上接種12天后的產(chǎn)孢量。發(fā)現(xiàn)在PDA平板上兩菌株的產(chǎn)孢量差別不大，但在含有CR、CFW、SDS、KCl、山梨醇和甘露醇的平板上，干擾菌株的產(chǎn)孢量明顯降低。
　　1.6、干擾MaFKS基因后菌絲的葡聚糖含量降低
　　測(cè)定菌絲壁β-1,3-葡聚糖的含量，發(fā)現(xiàn)干擾轉(zhuǎn)化菌株β-1,3-葡聚糖的含量只有野生菌株的5

8、1.32%。采用苯胺藍(lán)染色觀察菌絲壁β-1,3-葡聚糖的分布發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化菌株菌絲間隔帶區(qū)域熒光信號(hào)比野生菌株的要弱。說明減少M(fèi)aFKS的表達(dá)降低了綠僵菌菌絲壁β-1,3-葡聚糖的含量。
　　2、MaChsVII的克隆與功能分析
　　2.1、MaChsVII的克隆及序列分析
　　我們克隆了一個(gè)幾丁質(zhì)合成酶基因MaChsVII，序列分析表明該基因含有一個(gè)5427bp的ORF，編碼1784個(gè)氨基酸的蛋白。該蛋白的分子質(zhì)量為19

9、9.2kDa，等電點(diǎn)為5.57，具有6次跨膜區(qū)域。預(yù)測(cè)的MaChsⅦ蛋白序列的N端含有MMD區(qū)域，但比V類幾丁質(zhì)合成酶的MMD區(qū)域要短，并且不含有第五類幾丁質(zhì)合成酶特有的P-Loop、switchⅠ和switchⅡ。構(gòu)建進(jìn)化樹分析該基因?qū)儆赩II類幾丁質(zhì)合成酶基因。
　　2.2、利用基因敲除技術(shù)研究MaChsVII基因的功能
　　構(gòu)建了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因敲除載體pPK2-pB-MaChsⅦL/R，轉(zhuǎn)化綠僵菌后獲得敲除轉(zhuǎn)化菌株，

10、PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化菌株為同源重組。
　　2.3、MaChsVII基因影響綠僵菌細(xì)胞壁的完整性
　　觀察了△MaChsⅦ菌株在含有細(xì)胞壁干擾劑的培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)形態(tài)。發(fā)現(xiàn)在含有CR、CFW、SDS的PDA平板上，△MaChsⅦ菌株菌落大小比野生菌株要稍小，并且轉(zhuǎn)化菌株的氣生菌絲的生長(zhǎng)明顯受到抑制，然而在含有H2O2的PDA平板上，△MaChsⅦ菌株的長(zhǎng)勢(shì)比野生菌株要好。
　　2.4、MaChsVII基因與綠僵菌高滲透壓的耐

11、受性相關(guān)。
　　觀察△MaChsⅦ菌株在不同物質(zhì)提供高滲透壓條件下的菌落表型，發(fā)現(xiàn)在含有KCl的PDA平板上MaChsⅦ缺失菌株的菌落較小且呈黃褐色，而野生菌株的菌落表面則褶皺并且明顯開始產(chǎn)孢。在含有山梨醇及甘露醇的PDA平板上野生菌株菌落變得褶皺并且呈綠色，但是與野生型相比缺失菌株菌落稍小表面并且菌落呈深綠色。
　　2.5、MaChsVII基因與綠僵菌的毒力相關(guān)。
　　與野生型相比MaChsVII缺失菌株對(duì)蝗蟲的致死