綠僵菌和蝗蟲(chóng)中具有降解昆蟲(chóng)體壁功能蛋白酶基因的分離、克隆及功能研究.pdf

1、農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)是造成農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因,同時(shí)也給林業(yè)和牧業(yè)造成了巨大的災(zāi)害。飛蝗是一種洲際性農(nóng)業(yè)重大害蟲(chóng),在我國(guó),以東亞飛蝗[Locusta migratoria manilensis(Meyen)]分布面積廣,危害最為嚴(yán)重。因而加強(qiáng)對(duì)飛蝗等農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的研究和災(zāi)害的綜合防治,已成為關(guān)系我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定的重要因素。長(zhǎng)期以來(lái),化學(xué)農(nóng)藥在害蟲(chóng)的防治中起著主導(dǎo)作用,這將直接導(dǎo)致三大環(huán)境問(wèn)題:(1)污染環(huán)境,殘毒積累,最終危害人類(lèi)健康;(2)害蟲(chóng)

2、抗藥性直線上升，使化學(xué)農(nóng)藥用量不斷增加,導(dǎo)致惡性循環(huán);(3)殺傷天敵,破壞生態(tài)平衡,從而致使害蟲(chóng)再猖獗和次要害蟲(chóng)上升為主要害蟲(chóng)。為了降低環(huán)境污染,減少或禁用化學(xué)農(nóng)藥勢(shì)在必行,開(kāi)發(fā)高效、穩(wěn)定的生物農(nóng)藥已成為當(dāng)務(wù)之急。微生物殺蟲(chóng)劑具有無(wú)公害、無(wú)殘留、害蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn),日益受到人們的廣泛關(guān)注。而殺蟲(chóng)真菌是昆蟲(chóng)病原微生物(細(xì)菌、真菌和病毒)中最大的一個(gè)類(lèi)群,具有直接穿透寄主體壁和持續(xù)控制等優(yōu)點(diǎn),是其它微生物殺蟲(chóng)劑不可比擬的。綠僵菌是一種非

3、常有效防治蝗蟲(chóng)的殺蟲(chóng)真菌,但是同其它殺蟲(chóng)真菌一樣,存在著致死時(shí)間長(zhǎng)等不足,影響其廣泛應(yīng)用。昆蟲(chóng)的體壁是抵御真菌侵染的第一道物理屏障,因而殺蟲(chóng)真菌穿透寄主體壁的成功率和速度是影響其殺蟲(chóng)時(shí)間的重要因素之一。殺蟲(chóng)真菌依靠酶解作用和機(jī)械壓力穿透寄主體壁,在侵染過(guò)程中產(chǎn)生一系列的酶來(lái)降解昆蟲(chóng)表皮,其中蛋白酶起著主要作用。因而,來(lái)源于昆蟲(chóng)病原真菌的這類(lèi)蛋白酶基因,已成為利用基因工程手段,構(gòu)建高效殺蟲(chóng)真菌的重要毒力因子。同時(shí),除了昆蟲(chóng)病原真菌能產(chǎn)生降

4、解昆蟲(chóng)體壁的蛋白酶外,昆蟲(chóng)自身也能產(chǎn)生降解自身表皮的蛋白酶。在昆蟲(chóng)蛻皮過(guò)程中,昆蟲(chóng)會(huì)分泌大量蛻液,其中包含以蛋白酶為主的一系列水解酶,來(lái)降解老表皮,并回收利用促進(jìn)新表皮的合成。因此,本研究以昆蟲(chóng)病原真菌綠僵菌和東亞飛蝗為材料,分離、克隆具有殼降解功能的蛋白酶基因,并進(jìn)行相關(guān)的功能驗(yàn)證、分析。為發(fā)展高效、安全的基因工程殺蟲(chóng)真菌提供毒力基因和前期的基礎(chǔ)研究工作,這對(duì)于發(fā)展真菌殺蟲(chóng)劑及提高我國(guó)真菌農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力都具有重要的意義。同時(shí),昆

5、蟲(chóng)蛻液中的殼降解蛋白酶,與昆蟲(chóng)的蛻皮具有重要的關(guān)系,這類(lèi)蛋白酶的缺損,將導(dǎo)致昆蟲(chóng)不能蛻皮,并最終導(dǎo)致死亡,是潛在的殺蟲(chóng)靶標(biāo)。因此,研究昆蟲(chóng)殼降解蛋白酶基因及功能,對(duì)于研究昆蟲(chóng)的蛻皮生理發(fā)育過(guò)程,以及以這類(lèi)蛋白酶為靶標(biāo),建立新型、高效、安全的殺蟲(chóng)劑篩選模型都具有重要的意義。主要研究結(jié)果如下:(1)根據(jù)已報(bào)道的綠僵菌PR1A基因保守序列設(shè)計(jì)引物,從綠僵菌CQMa102中克隆PR1A基因,其DNA序列、mRNA序列和編碼蛋白的GenBank登

6、錄號(hào)分別為:AY839935,EF627449和ABR20899。其DNA序列全長(zhǎng)1571 bp,cDNA序列全長(zhǎng)1319 bp,其中包含一個(gè)1173 bp的開(kāi)放閱讀框和一個(gè)146 bp的3’端非編碼區(qū),開(kāi)放閱讀框編碼一個(gè)含390個(gè)氨基酸序列的蛋白。根據(jù)同源序列比對(duì)以及序列分析結(jié)果,表明PR1A屬于類(lèi)枯草桿菌絲氨酸蛋白酶(subtilisin-like serine protease,SLSP)家族。通過(guò)與來(lái)源于絲狀真菌、酵母、細(xì)菌、藍(lán)

7、細(xì)菌、無(wú)脊椎動(dòng)物及脊椎動(dòng)物的16種SLSP構(gòu)建同源樹(shù)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析,表明CQMa102 PR1A與絲狀真菌的SLSP具有非常高的同源性和很近的進(jìn)化關(guān)系,而且與綠僵菌Metarhizium anisopliae var. acridum strain ARSEF324 PR1A同源性高達(dá)99％。同時(shí),我們用CQMa102 PR1A基因構(gòu)建畢赤酵母分泌表達(dá)載體,并成功實(shí)現(xiàn)在畢赤酵母P. pastoris KM71中的分泌表達(dá)。用KM71原

8、始菌株和pPIC9K空載體轉(zhuǎn)化菌株作為對(duì)照,對(duì)重組菌株KM71/pPIC9K-PR1A表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析。SDS-PAGE和Western blot都顯示,在目標(biāo)位置26 kDa大小附近新增加一條帶,且與來(lái)源于綠僵菌的天然蛋白大小相同。另外,表達(dá)產(chǎn)物具有顯著的對(duì)PR1特異底物活性、總蛋白酶活性以及對(duì)蝗蟲(chóng)殼蛋白的降解活性。這些研究結(jié)果表明,我們成功克隆到CQMa102 PR1A基因,且通過(guò)功能表達(dá)證明該基因編碼蛋白具有降解蝗蟲(chóng)殼蛋白的功能。

9、(2)對(duì)來(lái)源于昆蟲(chóng)的類(lèi)胰蛋白酶和絲氨酸蛋白酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析,根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)兩對(duì)嵌套簡(jiǎn)并引物。選取東亞飛蝗五齡幼蟲(chóng)MFP活性增加最快時(shí)期的蟲(chóng)體提取mRNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,用所設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,克隆到一種新的蛻液蛋白酶基因,命名為L(zhǎng)m-TSP,其cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列GenBank登錄號(hào)分別為:EF081255和ABN13876。cDNA序列全長(zhǎng)1587 bp,其中包含一個(gè)735 bp的開(kāi)放閱讀框和一個(gè)852 b

10、p的3’端非編碼區(qū),開(kāi)放閱讀框編碼一個(gè)含244個(gè)氨基酸序列的蛋白。根據(jù)同源性搜索比對(duì)以及序列分析,表明Lm-TSP屬于類(lèi)胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶(trypsin-like serine protease,TLSP)家族。通過(guò)與來(lái)源于昆蟲(chóng)、蛛形綱動(dòng)物、哺乳動(dòng)物和細(xì)菌的14種TLSP構(gòu)建同源樹(shù)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析,表明Lm-TSP與來(lái)源于昆蟲(chóng)的TLSP有較高的同源性和很近的進(jìn)化關(guān)系,而且與來(lái)源于昆蟲(chóng)赤擬谷盜(Tribolium castaneum)

11、的TLSP同源性高達(dá)82%。RNAi研究結(jié)果表明,Lm-TSP基因的沉默將引起東亞飛蝗從四齡幼蟲(chóng)到五齡幼蟲(chóng),和從五齡幼蟲(chóng)到成蟲(chóng)蛻皮功能的喪失,這說(shuō)明Lm-TSP在東亞飛蝗蛻皮過(guò)程中起著重要作用。而且Lm-TSP基因的沉默同時(shí)會(huì)引起蛻液中總蛋白酶活性、特異蛋白酶活性和殼蛋白降解活性的急劇降低,繼而引起對(duì)昆蟲(chóng)老表皮降解功能的缺失,最終導(dǎo)致昆蟲(chóng)不能蛻皮而死亡。這些結(jié)果表明Lm-TSP與東亞飛蝗蛻皮過(guò)程相關(guān),是與昆蟲(chóng)蛻皮功能相關(guān)的第一個(gè)蛋白酶基