綠僵菌Mid1基因功能研究.pdf

1、昆蟲病原真菌是一類重要的生防微生物，與其他農(nóng)藥相比，具有選擇性強(qiáng)、環(huán)境污染小、易于改造等優(yōu)點(diǎn)。然而綠僵菌的致病力弱、產(chǎn)品儲(chǔ)存期短以及較強(qiáng)的環(huán)境依賴性等缺點(diǎn)嚴(yán)重限制了微生物農(nóng)藥的發(fā)展，因此，蟲生真菌致病機(jī)制的相關(guān)研究成為熱點(diǎn)，有關(guān)致病基因的研究也為提高綠僵菌毒力和菌株改造奠定了基礎(chǔ)。
　　許多病原真菌的致病性或耐受性都是受到Ca2+信號(hào)調(diào)控。Mid1，作為一種延伸激活的鈣離子通道蛋白，是外界鈣離子在一定條件下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的必經(jīng)之路，是

2、引起鈣離子變化從而影響真菌生理機(jī)能的重要因子。目前在昆蟲病原真菌中研究較少。本文主要以蝗綠僵菌為材料，利用已知的Mid1基因序列構(gòu)建敲除與回復(fù)載體分析該基因的功能。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　Mid1基因的克隆與功能分析
　?、費(fèi)id1基因信息學(xué)分析
　　根據(jù)綠僵菌基因組序列設(shè)計(jì)引物，克隆得到 Mid1基因，登錄號(hào)為XP007808776.1，開放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)1818bp，在線預(yù)測(cè)此蛋白編碼606個(gè)氨基

3、酸，等電點(diǎn)為6.27，蛋白質(zhì)分子量為87.43KDa。生物信息學(xué)分析表明Mid1蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)包含一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)保守的典型的半胱氨酸富集區(qū)C1和C2，C端含有一個(gè)信號(hào)肽。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示綠僵菌Mid1與金龜子綠僵菌Mid1親緣關(guān)系較近（95％相似性）。
　　②Mid1敲除菌株、回復(fù)菌株的獲得
　　為了研究綠僵菌Mid1基因的功能，利用同源重組的方法構(gòu)建了敲除載體，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了回復(fù)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化綠僵菌，經(jīng)

4、抗性篩選PCR驗(yàn)證篩及Southen雜交驗(yàn)證，得到正確的敲除與回復(fù)菌株。
　?、跰id1基因表達(dá)模式
　　為了分析Mid1在綠僵菌不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量，分別提取了48h菌絲，3、6、9、12天孢子時(shí)期，附著胞以及蟲菌體時(shí)期的RNA, RT-qPCR分析結(jié)果表明Mid1在附著胞時(shí)期表達(dá)量最高，也進(jìn)一步分析Mid1對(duì)毒力的影響提供依據(jù)。
　?、躆id1的缺失導(dǎo)致綠僵菌毒力降低
　　以東亞飛蝗五齡蟲為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其進(jìn)行

5、體表點(diǎn)滴和體內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：體表點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)中敲除菌株與野生型和回復(fù)菌株相比毒力下降，LT50推遲1天左右，而注射實(shí)驗(yàn)中敲除與野生型和回復(fù)相比毒力無(wú)顯著差異，我們推測(cè)Mid1的缺失影響了綠僵菌對(duì)寄主的體壁穿透過程。
　?、萸贸齅id1影響綠僵菌在蝗蟲血淋巴中的生長(zhǎng)
　　為了研究Mid1基因?qū)G僵菌在蝗蟲血淋巴中生長(zhǎng)的影響，利用體表點(diǎn)滴和體內(nèi)注射方法分析不同時(shí)間點(diǎn)血腔中蟲菌體的生長(zhǎng)情況。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)點(diǎn)滴接種時(shí)，血淋巴中Δ

6、Mid1出現(xiàn)蟲菌體時(shí)間晚于野生型與回復(fù)菌株，數(shù)量也顯著低于野生型與回復(fù)。而體內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)中，ΔMid1缺失菌株和野生型之間無(wú)顯著差異。
　　⑥Mid1基因影響綠僵菌附著胞形成率
　　對(duì)綠僵菌孢子在后翅上的萌發(fā)率和附著胞的形成率進(jìn)行了分析。結(jié)果表明ΔMid1菌株的孢子萌發(fā)率與野生型和回復(fù)菌株相比，無(wú)顯著差異；而ΔMid1菌株的附著胞形成率顯著低于野生型和回復(fù)菌株。說明Mid1的缺失影響綠僵菌在蝗蟲后翅上附著胞的形成，但不影響后翅

7、上孢子的萌發(fā)。
　?、?Mid1的缺失影響穿透體壁相關(guān)酶基因的表達(dá)
　　生測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Mid1可能影響蝗綠僵菌穿透昆蟲體壁的過程，因此通過qRT-PCR對(duì)穿透體壁過程中的相關(guān)基因枯草蛋白酶Pr1，Pr2以及幾丁質(zhì)酶CHI，CHII，酯酶等轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)。分析發(fā)現(xiàn)，Pr1，CHI與酯酶的表達(dá)量均下調(diào)，結(jié)果表明Mid1通過調(diào)控相關(guān)穿透基因的表達(dá)量從而影響毒力。
　?、唳id1對(duì)細(xì)胞破壞劑敏感但與綠僵菌抗逆性無(wú)關(guān)

8、>　　在加入了細(xì)胞壁破壞劑剛果紅（CR）與熒光增白劑（CFW）的1/4SDAY固體培養(yǎng)基上，敲除菌株ΔMid1菌落明顯小于WT與CP，說明Mid1影響菌株對(duì)CR和CFW的抗性。然而，紫外照射和濕熱處理分析顯示，Mid1的缺失不影響綠僵菌對(duì)紫外照射和濕熱的抗逆能力。
　?、幡id1菌株金屬離子敏感性增強(qiáng)
　　在加入了不同金屬離子如Ca2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+以及鈣離子螯合劑EGTA等的1/4SDAY固體培養(yǎng)基上，Δ

9、Mid1長(zhǎng)勢(shì)均弱于WT和CP。說明ΔMid1菌株在1/4SDAY固體培養(yǎng)基上對(duì)不同金屬離子具有敏感性。
　　⑩Mid1調(diào)控綠僵菌胞內(nèi)鈣離子運(yùn)輸
　　利用特異性的鈣離子熒光染料Fluo-3AM對(duì)ΔMid1，WT和CP菌株進(jìn)行染色。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)ΔMid1缺失菌株的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于WT和CP菌株，說明Mid1基因在蝗綠僵菌中調(diào)控胞內(nèi)鈣離子的運(yùn)輸。通過RT-qPCR對(duì)不同金屬離子對(duì)Mid1基因轉(zhuǎn)錄水平的影響進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在Ca