綠僵菌侵染相關(guān)基因腺苷酸環(huán)化酶基因的克隆及功能研究.pdf

1、農(nóng)業(yè)害蟲給農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲的防治成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要組成部分?；认x是國際性農(nóng)林害蟲之一，絕大多數(shù)的國家都存在著嚴(yán)重程度各不相同的蝗災(zāi)危害。金龜子綠僵菌(Metarhizium acidum)作為重要的昆蟲病原真菌，已被廣泛應(yīng)用，尤其是在對(duì)蝗蟲的防治中，已成為蝗蟲防治的主要微生物農(nóng)藥。但是病原真菌類的殺蝗蟲制劑在實(shí)際使用中受生產(chǎn)、儲(chǔ)存及田間的自然環(huán)境條件的影響，使得其使用有很大局限性，限制了綠僵菌作為生物殺蟲劑

2、投入到廣泛規(guī)?；貞?yīng)用中。所以，選育優(yōu)良的綠僵菌工程菌株由為關(guān)鍵。
　　 國內(nèi)外對(duì)昆蟲病原真菌的致病入侵機(jī)理進(jìn)行了深入的研究，主要是在侵染階段與宿主相互作用以及入侵宿主過程中分泌的蛋白酶類等的研究，比如：分生孢子是怎樣附著在昆蟲的體表，如何在侵染體壁后奪取昆蟲體內(nèi)的營養(yǎng)，侵染的結(jié)構(gòu)(如附著胞、侵染釘)的形成，怎么樣能成功地逃避昆蟲自身免疫應(yīng)答反應(yīng)，以及真菌產(chǎn)孢過程的調(diào)節(jié)等。在整個(gè)侵染過程中，病原真菌的作用同時(shí)受多種外界環(huán)境因素，

3、如熱擊、紫外的影響，同時(shí)也受昆蟲宿主的應(yīng)激反應(yīng)，如氧化、滲透壓、發(fā)熱的影響。在本研究中，我們從殺蝗病原真菌金龜子綠僵菌中克隆得到腺苷酸環(huán)化酶基因(MaAC)，該基因與多種真菌物種的腺苷酸環(huán)化酶基因有很高的同源性。采用RNAi干擾的方法分析MaAC對(duì)綠僵菌致病性及應(yīng)對(duì)外界環(huán)境和昆蟲宿主產(chǎn)生的不利影響的作用。主要研究結(jié)果如下：
　　 ①獲得MaAC基因的ORF和DNA全長，對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　 MaAC基因的OR

4、F為6492bp，cDNA序列的Genbank登錄號(hào)為JQ358775。預(yù)測(cè)該基因編碼2164個(gè)氨基酸。將該基因ORF與綠僵菌基因組數(shù)據(jù)庫比對(duì)，獲得基因組DNA全長為6888bp。利用DNAMAN軟件對(duì)cDNA序列和基因組DNA全長序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)含有兩個(gè)內(nèi)含子，分別位于距離起始密碼子940bp處和6204bp處。預(yù)測(cè)該基因分子量為541.2KDa，等電點(diǎn)為4.63，利用SignalP分析該基因編碼的蛋白沒有發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽。
　　

5、 ②RNA干擾的方法研究MaAC基因的功能。首先構(gòu)建RNAi干擾載體pK2-RNAi-MaAC通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化綠僵菌CQMa102，PCR驗(yàn)證篩選MaAC轉(zhuǎn)化子，定量PCR檢測(cè)突變菌株與野生菌株中MaAC基因的表達(dá)水平差異。檢測(cè)結(jié)果顯示干擾掉MaAC基因后，檢測(cè)的三個(gè)轉(zhuǎn)化子的干擾效率在56％-77％之間。
　　 ⑨在PDA和察式培養(yǎng)基上觀察MaAC基因干擾菌株與野生菌株的生長差異。相同濃度的干擾菌株和野生菌株的菌懸液分別接種在

6、PDA和察式培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比較，干擾突變菌株生長顯著被抑制。
　　 ④檢測(cè)MaAC基因干擾菌株與野生菌株的生長率。在PD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)干擾菌株和野生菌株，用CellTiter96()AQueous One Solution Assay測(cè)定菌液中細(xì)胞數(shù)，檢測(cè)結(jié)果表明，干擾菌株的生長明顯慢于野生菌株。
　　 ⑤測(cè)定MaAC基因干擾菌株中cAMP含量。在PD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)干擾菌株和野生菌株，用cAM

7、P酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定體內(nèi)cAMP含量，測(cè)定結(jié)果顯示，干擾MaAC基因后，干擾菌株cAMP含量顯著少于野生菌株。
　　 ⑥對(duì)MaAC基因干擾菌株孢子進(jìn)行毒力測(cè)定。體表侵染和體內(nèi)注射兩種測(cè)定方法侵染蝗蟲，觀察蝗蟲死亡情況。干擾菌株對(duì)蝗蟲的毒力顯著降低，半致死時(shí)間比野生菌株滯后近一天，說明MaAC是毒力相關(guān)基因。
　　 ⑦測(cè)定MaAC基因干擾菌株抗脅迫能力。在含有H2O2和KCl的1/4SDAY培養(yǎng)基上觀察發(fā)現(xiàn)，干擾菌株生長較