甘薯腺苷酸激酶基因的克隆分析及載體構(gòu)建.pdf

1、甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam)是全世界的主要農(nóng)作物之一和重要的淀粉作物?，F(xiàn)代生物技術(shù)和基因工程技術(shù)的發(fā)展為獲取高淀粉甘薯新品種提供了可能，其前提是對(duì)其淀粉代謝途徑的深入研究。 腺苷酸激酶(EC.2.7.4.3，adenylate kinaSe，ADK)催化ATP和AMP合成兩分子ADP的可逆反應(yīng)，是調(diào)控這三種前體分子在淀粉代謝庫(kù)和核酸代謝庫(kù)中分配的關(guān)鍵酶。為研究ADK在甘薯淀粉合成中的作用以及為甘薯淀粉代謝

2、工程提供候選基因，本研究采用RACE技術(shù)從自有淀粉專用型甘薯新品種“渝蘇303”(國(guó)審薯2002006)中克隆了ADK基因cDNA全長(zhǎng)(IbADK，GellBank 登錄號(hào)：EF562533)，并對(duì)該基因及其所編碼的ADK蛋白進(jìn)行了詳盡的生物信息學(xué)分析和組織表達(dá)譜分析。獲得結(jié)果如下：根據(jù)已知腺苷酸激酶基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲得592bp的核心片段；BLAST分析表明該片段與其它植物ADK同源，初步確定為甘薯的ADK基因核心片段；根

3、據(jù)該序列設(shè)計(jì)用于3’-RAcE和5’-RAcE的基因特異性引物，擴(kuò)增獲得548bp的3’-末端和3 14bp的5’-末端：將核心片段、3’-末端和5’-末端序列進(jìn)行拼接，獲得甘薯ADK基因的cDNA電子全長(zhǎng)，進(jìn)而設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得其物理全長(zhǎng)。IbADK全長(zhǎng)1314bp，其編碼區(qū)長(zhǎng)度為855 bp，編碼長(zhǎng)度為284個(gè)氨基酸殘基的ADK蛋白(IbADK)；生物信息學(xué)預(yù)測(cè)IbADK分子量為30.86 kDa，等電點(diǎn)為6.46；BLAST分析顯示

4、IbADK與馬鈴薯ADK序列相似性達(dá)到83％；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)lbADK的N-端有一段長(zhǎng)度為22個(gè)氨基酸殘基的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，表明該蛋白定位于質(zhì)體，這與淀粉合成定位于質(zhì)體相一致；將IbADK與植物ADKs構(gòu)建分子發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯ADK蛋白與IbADK聚為一類，表明兩者在進(jìn)化上比較接近，這與BLAST結(jié)果相符；對(duì)IbADK進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，表明其中包含26.06％的α-螺旋、23.59％ 的片層和50.35％的隨機(jī)卷曲；進(jìn)一步對(duì)IbA

5、DK進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模，表明該蛋白能夠正常折疊形成典型的ADK蛋白三維結(jié)構(gòu)，并在其三維結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了AMP結(jié)合位點(diǎn)和ATP-AMP(Ap5A)結(jié)合位點(diǎn)；利用半定量 RT-PCR技術(shù)對(duì)IbADK進(jìn)行組織表達(dá)譜分析，表明該基因在塊根和幼葉中表達(dá)量最高，在成熟葉片和莖中表達(dá)量次之，在葉柄中則檢測(cè)不到IbADK的表達(dá)。已有研究表明，淀粉合成定位于兩種質(zhì)體，即葉片中的葉綠體和塊根中的淀粉體。因此在甘薯塊根和幼葉中IbADK的高表達(dá)，有利于促進(jìn)這兩種代

6、謝活躍的組織中ATP、AMP和ADP分子的代謝，進(jìn)而調(diào)節(jié)淀粉代謝和核苷酸代謝。對(duì)IbADK的克隆分析和性質(zhì)研究，有助于在分子遺傳學(xué)水平上了解IbADK的功能，并且對(duì)于研究甘薯淀粉合成的分子機(jī)理有一定幫助。 前人研究表明：適當(dāng)下調(diào)ADK表達(dá)量，可以促使腺苷酸代謝庫(kù)向淀粉合成的方向流動(dòng)。本研究設(shè)計(jì)一對(duì)帶酶切位點(diǎn)的引物，克隆IbADK的編碼區(qū)，反向插入到植物表達(dá)載體pHB中，構(gòu)建IbADK反義表達(dá)載體pHB-albADK，同時(shí)構(gòu)建正義