蠟梅脫腺苷酸酶基因CpCAF1的克隆及功能分析.pdf

1、蠟梅[Chimonanthus praecox（L.）Link]為蠟梅科蠟梅屬的落葉喬灌木植物，是我國(guó)特產(chǎn)的傳統(tǒng)名花，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值。CAF1是一種脫腺苷酸酶，在mRNA降解中起著重要作用，脫腺苷酸化作用是大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA降解的第一步。mRNA降解可以對(duì)過時(shí)的mRNA進(jìn)行及時(shí)清除，同時(shí)對(duì)發(fā)生突變有害的mRNA進(jìn)行降解，能夠保證細(xì)胞正常的生命活動(dòng)，也可以引起基因表達(dá)變化、改變生物學(xué)性狀，作為基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵步驟

2、之一，對(duì)生物轉(zhuǎn)錄組重建起重要作用。目前僅有擬南芥、辣椒和水稻CAF1基因功能的研究報(bào)導(dǎo)，其結(jié)果表明該基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及生物和非生物脅迫的應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。
　　1.CpCAF1基因的結(jié)構(gòu)特征和編碼蛋白特征
　　在以構(gòu)建的蠟梅花cDNA文庫基礎(chǔ)上，通過隨機(jī)測(cè)序的方法獲得CpCAF1基因的cDNA序列。DNAstar軟件分析發(fā)現(xiàn)，獲得的cDNA序列包含一個(gè)807bp的完整開放閱讀框（Open Reading Frame

3、，ORF）；ProtParam軟件在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明：蠟梅CpCAF1基因編碼269個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子式為C1371H2087N349O410S11；分子量為30.37KD，等電點(diǎn)pI是4.70；不穩(wěn)定系數(shù)（instability index）為25.90，是一個(gè)穩(wěn)定蛋白；SignalP在線軟件預(yù)測(cè)顯示，CpCAF1蛋白不具信號(hào)肽序列；PSORT軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，表明該蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)。
　　利用DNAstar軟件5.0軟件

4、進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果顯示蠟梅CpCAF1基因編碼蛋白與其他物種CAF1基因編碼蛋白的相似性較高，與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、梅(Prunus mume)、葡萄（Vitis viifera）、可可（Theobroma cacao）、油棕（Elaeis guineensis）、荷花（Nelumbo nucifera）、蓖麻（Ricinus communis），相似度高達(dá)98％，結(jié)構(gòu)比較保守。CpCAF1蛋白屬于D

5、EDD核酸酶家族的DEDDh亞族，其活性區(qū)由3個(gè)天門冬甘酸（D）、1個(gè)谷氨酸（E）以及鄰近的組氨酸（h）組成。
　　2.CpCAF1基因在蠟梅中的表達(dá)特征分析
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)CpCAF1基因在不同組織、不同開花時(shí)期以及不同激素處理蠟梅切花進(jìn)行表達(dá)特征分析。結(jié)果表明，CpCAF1基因在根、莖、葉、花各種組織中均有不同程度表達(dá)，其中在老葉中表達(dá)量最高，在根中表達(dá)量最低；在不同開花階段，CpCAF1基因在各個(gè)時(shí)期都有

6、所表達(dá)，在衰敗期表達(dá)量最高，在花蕾期表達(dá)量最低；不同激素處理蠟梅切花，SA激素誘導(dǎo)CpCAF1基因的表達(dá)，在12h時(shí)達(dá)到最高；ABA和GA3處理都不同程度的抑制CpCAF1基因的表達(dá)，推測(cè)CpCAF1基因參與SA、ABA和GA3信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
　　3.CpCAF1基因轉(zhuǎn)擬南芥的遺傳研究
　　將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pCAMBIA2301G-CpCAF1轉(zhuǎn)入農(nóng)桿EHA105中，利用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，通過Kan抗性篩選、GUS

7、染色、DNA鑒定，最終獲得了7個(gè)T4代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)CpCAF1基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，選擇高表達(dá)株系CpCAF1-5、低表達(dá)株系CpCAF1-3進(jìn)行表型觀察和相關(guān)實(shí)驗(yàn)處理。
　　轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和野生型植株表型觀察結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的抽薹時(shí)間、蓮座葉側(cè)枝、和莖生葉側(cè)枝形成時(shí)間、第一個(gè)花序、第一朵花和第一個(gè)果莢出現(xiàn)時(shí)間都早于野生型植株。轉(zhuǎn)基因株系的根生長(zhǎng)、側(cè)枝生長(zhǎng)、蓮座葉生長(zhǎng)和果