蠟梅病程相關(guān)蛋白基因CpPR-1的克隆及功能初步分析.pdf

1、病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein，PRP)是植物在受到一些化學(xué)物質(zhì)的誘導(dǎo)、鹽害、病原物(如真菌、細(xì)菌、病毒)的侵染等逆境脅迫時(shí)發(fā)生一系列防衛(wèi)反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生出一些新的蛋白質(zhì)。迄今為止，隨著研究的不斷深入，已經(jīng)在30多種植物中誘發(fā)到了病程相關(guān)蛋白并得到了克隆。PR蛋白可分為PR-1、PR-2、PR-3、PR-4等共17類(lèi)。其中PR-1家族在受病原或水楊酸誘導(dǎo)的PR蛋白中占據(jù)著統(tǒng)治地位，植物PR-1在結(jié)構(gòu)上具

2、有高度序列保守性。
　　 本文在已有的研究基礎(chǔ)上，從蠟梅cDNA文庫(kù)中克隆了一個(gè)蠟梅病程相關(guān)蛋白1基因，并對(duì)基因的編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析及功能初步預(yù)測(cè)，通過(guò)構(gòu)建植物表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行脅迫研究，分析PR-1蛋白基因的功能。主要研究結(jié)果包括：⑴CpPR-1及編碼蛋白的生物信息學(xué)分析。在已經(jīng)構(gòu)建的蠟梅花cDNA文庫(kù)及EST分析的基礎(chǔ)上，通過(guò)文庫(kù)cDNA全長(zhǎng)測(cè)序，得到了大小為得到其全長(zhǎng)為1

3、199bp，包含1個(gè)486bp的ORE，編碼蛋白由161個(gè)氨基酸殘基組成，其中堿性氨基酸14個(gè)，酸性氨基酸21個(gè)，無(wú)內(nèi)含子的存在。⑵植物表達(dá)載體的構(gòu)建。將該基因的的cDNA編碼序列連接到植物表達(dá)載體pcAMBIA2301g中，經(jīng)過(guò)酶切和PCR驗(yàn)證，成功構(gòu)建了克隆載體pCAM-CpPR-1。為進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。⑶對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將含有蠟梅病程相關(guān)蛋白基因CpPR-1的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入野生煙草中

4、，經(jīng)過(guò)GUS染色，Km+抗性篩選檢測(cè)，和轉(zhuǎn)化煙草DNA PCR檢測(cè)，獲得轉(zhuǎn)基因植株含CpPR-1基因的的有11株。⑷轉(zhuǎn)基因植株的脅迫分析。50mM CuSO4處理5天后對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)狀況出現(xiàn)明顯差異，野生型植株嚴(yán)重萎蔫，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)基本正常，有輕微萎蔫癥狀，初步說(shuō)明蠟梅PR-1基因可能具有抗重金屬脅迫的功能。接種煙草花葉病毒7天后，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草均出現(xiàn)一定的感病癥狀，枯斑大小及數(shù)量無(wú)明顯差異，這表明煙草PR-1基因的表達(dá)