蠟梅擴(kuò)張蛋白基因CpEXP1的表達(dá)分析及其功能驗(yàn)證.pdf

1、蠟梅(Chimonanthus praecox(Linn.) Link)，蠟梅科(Calycanthaceae)蠟梅屬(ChimonanthusLindl.)木本植物，原產(chǎn)于我國(guó)。其冬季開花色澤金黃并帶有香味，是名貴的木本切花。但在蠟梅切枝采收以及貯藏運(yùn)輸過(guò)程中容易落蕾落花，尤其是中蕾期花蕾的脫落直接影響了蠟梅作為鮮切花的開發(fā)應(yīng)用。以往關(guān)于蠟梅切花保鮮的研究基本停留在生理生化水平，而且缺少對(duì)落蕾問(wèn)題的專門研究。
　　近些年研究發(fā)現(xiàn)

2、，擴(kuò)張蛋白與器官脫落關(guān)系密切。2009年，我們?cè)谙灻返难芯恐蟹蛛x得到CpEXP1基因(GeneBank accession no.JN700522)，序列分析及同源性比較發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆讦?擴(kuò)張蛋白基因。但該基因的功能尚未明確。如果該基因的表達(dá)與蠟梅花蕾脫落存在相關(guān)性，我們就可以考慮通過(guò)調(diào)控該基因的表達(dá)來(lái)進(jìn)一步深入探索蠟梅花蕾脫落的機(jī)理，為尋找抑制蠟梅花蕾脫落的措施提供新思路。
　　本研究以素心蠟梅（Ch.praecox var.c

3、oncolor Makino）為材料，在克隆CpEXP1基因的基礎(chǔ)上進(jìn)行了原核表達(dá)和重組蛋白活性分析;并對(duì)不同組織、不同開花階段中CpEXP1基因的表達(dá)進(jìn)行了研究;在花蕾脫落力分級(jí)的基礎(chǔ)上對(duì)蠟梅花梗離層形成解剖結(jié)構(gòu)、CpEXP1基因的表達(dá)以及擴(kuò)張蛋白活性的相關(guān)性進(jìn)行了分析;通過(guò)構(gòu)建植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，對(duì)該基因的其它功能進(jìn)行了鑒定。最后，對(duì)CpEXP1基因啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆和功能分析。主要結(jié)果如下:
　　(1)原核表達(dá)及其產(chǎn)物活

4、性分析
　　成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32a(+)-CpEXP1，將其導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)獲得了CpEXP1重組蛋白。利用MagneHisTM蛋白純化回收試劑盒獲得了純化的重組蛋白?；钚詼y(cè)定表明，CpEXP1重組蛋白具有體外活性，能夠促進(jìn)大豆幼苗下胚軸的伸長(zhǎng)。將提取的重組蛋白添加到不同培養(yǎng)階段的麻點(diǎn)百合培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)重組蛋白對(duì)麻點(diǎn)百合愈傷組織的分化無(wú)顯著影響，但對(duì)增殖以及生根有明顯促進(jìn)作用，并且隨著重組蛋白濃

5、度的增加，增殖率以及生根率顯著提高，組培苗長(zhǎng)勢(shì)也顯著增強(qiáng)。
　　(2)蠟梅開花階段劃分與脫落力分級(jí)
　　素心蠟梅花蕾著生以1級(jí)分枝為主，其中短于20cm的中等枝以及短枝占80.0％，花蕾著生量占82.4％，構(gòu)成了蠟梅切枝的主要觀賞枝組;以花蕾發(fā)育過(guò)程中花徑、雌雄蕊形態(tài)以及香味等作為依據(jù)，將素心蠟梅的開花過(guò)程劃分為小蕾期、中蕾期、大蕾期、初開期、盛開期、初萎期和萎蔫期7個(gè)階段;采用單因子實(shí)驗(yàn)對(duì)蕾?gòu)健⑶o粗以及斷面直徑與脫落力的關(guān)

6、系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)莖粗與花蕾脫落力關(guān)系最為密切，相關(guān)性R2為0.1216，依次是蕾?gòu)胶蛿嗝嬷睆?，相關(guān)性R2分別為0.0409、0.0369;以脫落力為依據(jù)，將蠟梅中蕾期花蕾分為4組，即Ⅰ:0N＜脫落力＜1.4N，Ⅱ:1.4≤脫落力＜2.8N，Ⅲ:2.8≤脫落力＜4.2N，Ⅳ:脫落力≥4.2N。
　　(3) CpEXP1基因在蠟梅中的表達(dá)及其與擴(kuò)張蛋白活性、離層形成相關(guān)性分析
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)蠟梅不同組織、不同

7、開花階段以及不同脫落力花梗中CpEXP1基因的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，CpEXP1基因的表達(dá)量存在明顯的時(shí)空特異性。其中在花器官的表達(dá)量明顯高于營(yíng)養(yǎng)器官。11個(gè)組織中Cp EXP1基因的表達(dá)由高到低依次是雄蕊、內(nèi)花被片、雌蕊、全花、中花被片、外花被片、成熟葉片、根、莖、子葉、幼葉;在花發(fā)育不同階段分析中，萎蔫期花蕾中未提取到RNA，其余6個(gè)階段中CpEXP1基因的表達(dá)也存在差異。表達(dá)量由高到低依次是:初開期、盛開期、大蕾期、中蕾期、初

8、萎期、小蕾期;在不同脫落力下的花梗分析中，自然脫落花梗中CpEXP1基因的表達(dá)量最高，依次是:A(0N＜脫落力＜1.4N)、D（脫落力≥4.2N）、C（2.8≤脫落力＜4.2N）、B（1.4≤脫落力＜2.8N）。通過(guò)對(duì)不同脫落力下的花梗中擴(kuò)張蛋白活性的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張蛋白的活性與CpEXP1基因的表達(dá)存在正相關(guān)。
　　采用查狄倫測(cè)力計(jì)以及蛋白體外重組法對(duì)瓶插蠟梅花梗脫落力和蛋白活性進(jìn)行了研究，同時(shí)采用石蠟切片法對(duì)花梗離層的形成進(jìn)行了

9、觀察。結(jié)果表明:1）脫落力與落蕾量呈負(fù)相關(guān)，與花梗離層發(fā)育正相關(guān)，脫落力可以作為離層發(fā)育階段的劃分依據(jù);2）在脫落過(guò)程中，CpEXP1基因的表達(dá)及其產(chǎn)物主要在蠟梅花蕾離層發(fā)育后期起作用。在瓶插前期，擴(kuò)張蛋白活性和CpEXP1基因的表達(dá)量都穩(wěn)定在相對(duì)較低的水平，脫落力下降和離層的發(fā)育也相對(duì)緩慢。到了后期，該基因的表達(dá)和蛋白活性迅速增強(qiáng)，此時(shí)脫落力顯著下降，離區(qū)細(xì)胞嚴(yán)重解體并導(dǎo)致離區(qū)斷裂。
　　(4) CpEXP1基因植物表達(dá)載體構(gòu)建

10、及在擬南芥中的表達(dá)
　　根據(jù)NCBI登錄的核苷酸序列，克隆了蠟梅CpEXP1基因的cDNA編碼框全長(zhǎng)，并構(gòu)建了該基因的植物表達(dá)載體CpEXP1-2301G。通過(guò)花序浸潤(rùn)法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥T2代。和野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥的花序和葉片長(zhǎng)度、葉形指數(shù)、葉表絨毛密度均較野生型增加，而葉寬變化不明顯。轉(zhuǎn)基因植株葉片邊緣反卷、畸形，葉片枯萎期、花期以及果實(shí)成熟期也均較野生型提前。果柄脫落力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株成熟果莢果柄處脫落力

11、較野生型明顯降低。表明CpEXP1基因的表達(dá)與形態(tài)建成、生長(zhǎng)發(fā)育周期以及脫落密切相關(guān)。
　　(5)蠟梅CpEXP1基因啟動(dòng)子的克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)分析
　　利用hiTAIL-PCR法分離得到了長(zhǎng)度為2521bp的CpEXP1基因啟動(dòng)子區(qū)序列CpEXP1-pro。該啟動(dòng)子除具有啟動(dòng)子基本元件外，還含有多種光應(yīng)答元件、高溫及低溫脅迫響應(yīng)元件、水楊酸相應(yīng)元件以及與種子和胚乳特異表達(dá)相關(guān)的元件。成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體PBI121-

12、CpEXP1-pro，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入煙草進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，檢測(cè)到該啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)。將CpEXP1-pro啟動(dòng)子導(dǎo)入擬南芥中。GUS染色發(fā)現(xiàn)，在種子萌芽期和開花結(jié)實(shí)期該啟動(dòng)子活性最強(qiáng)，子葉期以及真葉幼苗期未檢測(cè)到GUS活性;葉片染色發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子隨著葉片成熟衰老表達(dá)活性逐漸增強(qiáng)，尤其在老葉葉柄處活性最強(qiáng);在果莢發(fā)育前期，GUS活性最強(qiáng)，隨后逐漸降低。當(dāng)果莢成熟時(shí)僅在果柄處檢測(cè)到活性。表明CpEXP1-pro啟動(dòng)子的啟動(dòng)