蠟梅肉桂醇脫氫酶基因CpCAD的克隆、表達特性分析及功能驗證.pdf

1、木質(zhì)素(Lignin)存在于植物木質(zhì)化的機械組織和輸導(dǎo)組織的細胞壁中，具有提高細胞壁的不透水性和莖的機械強度、增加細胞壁強度、以及增強液體輸導(dǎo)能力的功能，其通過有效物理化學(xué)屏障機制在植物抵抗外界不良環(huán)境中起著重要作用。肉桂醇脫氫酶(Cinnamylalcoholdehydrogenase(CAD))是控制木質(zhì)素生物合成途徑的關(guān)鍵酶之一。
　　 本研究在實驗室已構(gòu)建的蠟梅（Chimonanthuspraecox）花cDNA文庫的基

2、礎(chǔ)上，通過隨機測序獲得了與植物CAD基因具有高度同源性的EST序列，對其編碼蛋白進行生物信息學(xué)分析;通過轉(zhuǎn)錄水平的表達分析，研究該基因在蠟梅的不同組織、花器官、花發(fā)育不同時期的表達特征及在CuSO4和ABA脅迫處理下的表達特征;進一步構(gòu)建了植物超表達載體并轉(zhuǎn)化模式植物煙草，對其功能進行驗證。主要取得了以下結(jié)果:
　　 1.CpCADcDNA全長1432bp，無內(nèi)含子，其中開放閱讀框為936bp，編碼一個311個氨基酸長的蛋白質(zhì)，

3、序列同源比對表明:蠟梅CpCAD的基因序列與蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、山茶（Camelliasinensis）、葡萄（Vitisvinifera）中肉桂醇脫氫酶(CAD)基因序列的同源性分別為95％，90％和86％。編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析表明CpCAD蛋白屬于CAD1家族成員，在其氨基酸序列的N端具有醇脫氫酶的典型保守結(jié)構(gòu)域:NAD(P)輔酶結(jié)合位點(NAD(P)bindingsite);Zn結(jié)合的催化位點(c

4、atalyticZnbindingsite)和與Zn結(jié)合的結(jié)構(gòu)位點(structuralZnbindingsite);底物結(jié)合位點(putativesubstratebindingsite);一個二聚體界面(dimerinterface);屬于MDR超家族保守結(jié)構(gòu)域。二級結(jié)構(gòu)分析表明:CpCAD蛋白由21.86％的α-螺旋、22.19％的延伸鏈、55.95％的無規(guī)則卷曲構(gòu)成。無明顯的跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明該蛋白可能在細

5、胞核、線粒體基質(zhì)、溶酶體（內(nèi)腔）、過氧化物酶體中發(fā)揮作用。該蛋白存在14個絲氨酸磷酸化位點、1個蘇氨酸磷酸化位點、2個酪氨酸磷酸化位點。三級結(jié)構(gòu)模型預(yù)測該蛋白是由兩個亞基組成的二聚體，具有典型的Rossmann折疊(β-α-β)結(jié)構(gòu)域，是輔酶的主要結(jié)合區(qū)域，無二硫鍵。
　　 2.對CpCAD進行實時熒光定量PCR分析表明:CpCAD基因在蠟梅不同組織中表達有差異，根、莖、葉中基本不表達，在花中的表達量最高，其中以外瓣的表達量最高

6、，中瓣和內(nèi)瓣表達量持平且低于外瓣，雄蕊、雌蕊中的表達量低于中瓣和內(nèi)瓣并依次降低但高于根莖葉?；òl(fā)育不同時期表達有明顯差異，在萌動期和蕾期表達量最低，從蕾期到達露瓣期表達量迅速升高，在初開期和盛開期進一步升高，并在盛開期時達到最高，盛開之后進入落花期時表達量降低且仍高于萌動期和蕾期。CuSO4脅迫會引起CpCAD表達量的升高，并在處理了0.25h后達到最高水平，在0.25-1h之間表達量迅速降低，并在6h和12h時表達量又有所升高。ABA

7、脅迫能抑制CpCAD的表達:在ABA脅迫0.25h后表達量就降到最低，在隨后的1h、6h和12h其表達量逐漸升高但都低于對照的表達量。
　　 3.通過雙酶切及膠回收純化、連接及轉(zhuǎn)化等過程將CpCAD基因連接到植物表達載體pCAMBIA2301g中。利用XbaⅠ和EcoRI進行雙酶切及PCR驗證，表明成功構(gòu)建了攜有目的基因的植物表達載體pCAMBIA2301g-CpCAD，并通過電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101。應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將

8、攜有pCAMBIA2301g-CpCAD質(zhì)粒的農(nóng)桿菌導(dǎo)入野生型煙草植株中，通過抗性篩選、GUS組織化學(xué)染色、提取植物DNA并進行PCR擴增檢測，獲得28株轉(zhuǎn)基因煙草植株。
　　 4.選取部分檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因株系進行硫酸銅脅迫，并測定葉綠素含量、SOD酶活性、丙二醛含量等生理指標;與對照（非轉(zhuǎn)基因植株）相比，陽性轉(zhuǎn)基因植株葉綠體色素含量包括葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素均高于對照;超氧化物歧化酶(SOD)的活性高于對照植株;丙二醛