家蠶山梨醇脫氫酶基因的時(shí)空特異表達(dá)及啟動(dòng)子特性分析.pdf

1、山梨醇脫氫酶（sorbitol dehydrogenase，SDH）是山梨醇轉(zhuǎn)化為糖原的關(guān)鍵酶。家蠶有3個(gè)SDH基因，即BmSDH-1、BmSDH-2a和BmSDH-2b，均位于家蠶第21號(hào)染色體。家蠶卵中山梨醇含量的變化與卵期滯育的發(fā)動(dòng)、持續(xù)和停止有著密切的平行關(guān)系。以往的研究集中于BmSDH在卵期的表達(dá)及酶活情況，對(duì)于家蠶其它時(shí)期和組織的表達(dá)的研究較少，也未見(jiàn)BmSDH啟動(dòng)子特性分析。
　　本論文在生物信息學(xué)分析BmSDH-1

2、、BmSDH-2a和BmSDH-2b基因的結(jié)構(gòu)、同源性以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，用RT-PCR的方法分析了3個(gè)BmSDH基因的時(shí)空表達(dá)特性，比較了25℃明催青和17.5℃暗催青兩種不同催青條件對(duì)家蠶后期BmSDH表達(dá)的影響；克隆了BmSDH-2a啟動(dòng)子片段，分析了其轉(zhuǎn)錄特性。
　　1. BmSDH的生物信息學(xué)分析
　　BmSDH-1基因全長(zhǎng)6.035kb，由8個(gè)外顯子7個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成；BmSDH-2a基因全長(zhǎng)10.75kb，由6

3、個(gè)外顯子5個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成；BmSDH-2b基因全長(zhǎng)約10.15kb，由8個(gè)外顯子7個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。一級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示 BmSDH-1與 BmSDH-2a， BmSDH-2b之間的相似度均為49.7％，BmSDH-2a和 BmSDH-2b的相似度為96.4%。用MEGA4.0軟件構(gòu)建了BmSDH-1，-2a和-2b與其他13個(gè)物種（包括昆蟲(chóng)、兩棲類、哺乳和人類）基于同源蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示BmSDH-1獨(dú)立成一個(gè)亞支，BmSDH

4、-2a和-2b屬于同一個(gè)分支，它們與蜜蜂、熊蜂以及印度跳蟻等昆蟲(chóng)的親緣關(guān)系較近。
　　2. BmSDH基因時(shí)空表達(dá)特性分析及不同催青條件對(duì)表達(dá)的影響
　　根據(jù)家蠶二化性品種子代滯育性受親代胚胎期催青條件調(diào)控的原理，即25℃明催青則子代卵滯育，而20℃以下低溫暗催青則子代卵為非滯育。以二化性品種“秋豐”越年活化卵為材料，采用蛾區(qū)半分法，分別用25℃明催青和17.5℃暗催青處理，孵化后25℃常規(guī)方法桑葉飼養(yǎng)，羽化后同一處理內(nèi)的雌

5、雄蛾交配制種。利用半定量RT-PCR的方法，分析不同發(fā)育時(shí)期的雌性蠶體及不同組織中BmSDH轉(zhuǎn)錄水平，以及25℃明催青和17.5℃暗催青對(duì)BmSDH轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示BmSDH-1、BmSDH-2a和 BmSDH-2b在“秋豐”品種的各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)；在幼蟲(chóng)期5齡3 d，BmSDH-1在常溫明催青組脂肪體中轉(zhuǎn)錄水平較高，BmSDH-2a和BmSDH-2b在常溫明催青條件下的血液、脂肪體和卵巢中轉(zhuǎn)錄水平均高于低溫暗催青處理組；在

6、蛹期3 d，BmSDH-2a和BmSDH-2b在常溫明催青條件下血液和卵巢中的轉(zhuǎn)錄水平均低于低溫暗催青處理組；在次代卵產(chǎn)下后6～24 h期間，BmSDH-1的轉(zhuǎn)錄水平較低且沒(méi)有明顯變化；而B(niǎo)mSDH-2a和BmSDH-2b的轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，但是2個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平在不同催青處理中未見(jiàn)明顯變化。說(shuō)明BmSDH-1和蠶卵滯育與否沒(méi)有直接關(guān)系，而B(niǎo)mSDH-2a和BmSDH-2b與家蠶二化性品種卵滯育與否有重要的平行關(guān)系。
　　3. B

7、mSDH-2a基因啟動(dòng)子的克隆和特性分析
　　根據(jù)家蠶基因組中BmSDH-2a基因上游啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)2個(gè)上游和1個(gè)下游引物，以5齡后部絲腺基因組DNA為模板，用PCR方法克隆BmSDH-2a基因上游674bp和355 bp的啟動(dòng)子片段BmSDH-2aP-674、BmSDH-2aP-355。在線軟件預(yù)測(cè)分析顯示，克隆的674bp長(zhǎng)度片段含有核心啟動(dòng)子區(qū)，其中包括 TATA-盒和 GC盒，以及一些與胚胎發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄

8、因子結(jié)合位點(diǎn)，如 GATA-1、HSF1、CREB、CdxA、cap和Oct-1等，其中后4個(gè)多次出現(xiàn)。以pGL3.0 basic為載體，螢火蟲(chóng)熒光素酶基因luciferace（luc）為報(bào)告基因，分別構(gòu)建不同長(zhǎng)度 BmSDH-2a啟動(dòng)子控制的報(bào)告質(zhì)粒 pGL-BmSDH-2aP-674-luc, pGL-BmSDH-2aP-355-luc；分別轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染pGL3.0 basic-luc的細(xì)胞為對(duì)照，72h后收集細(xì)胞，在