茶樹中三個與茶尺蠖取食誘導相關的肉桂醇脫氫酶(CAD)基因克隆與功能分析.pdf

1、木質素是由多種簡單的苯丙烷及其衍生物聚合形成的復雜聚合物，其通過有效物理化學屏障在植物抵抗病、蟲害侵入中起著重要作用。而肉桂醇脫氫酶(CAD)是控制木質素生物合成途徑的關鍵酶之一，然而茶樹體內 CAD基因相關研究及其與抗蟲性之間的關系研究至今未見報道。本論文主要對茶樹葉片中的三個與茶尺蠖取食誘導相關的 CAD基因進行了 cDNA克隆，鑒定和表達特征分析。主要結果如下：
　　 1．基于本課題組建立的茶樹被茶尺蠖取食誘導前后的 cD

2、NA消減雜交文庫（SSH）和茶樹全器官轉錄組庫獲得的 3 條與 CAD基因同源性很高的 EST序列，利用 RACE 技術分別克隆了編碼 CAD基因的全長 cDNA序列，其中 1條來自于SSH 編碼的CAD 命名為CAD2，2 條來自于轉錄組庫編碼的CAD分別命名為CAD1和CAD3。CAD2基因全長為 1574bp，開放閱讀框972bp，編碼 324個氨基酸；CAD1基因全長為 1386bp，開放閱讀框 1146bp，編碼 382個氨基

3、酸； CAD3 全長為1350bp，開放閱讀框1083bp，編碼361個氨基酸。
　　 并將三個基因的序列遞交到 GenBank，登錄號分別為 HM440158、HQ880207和HQ880208。
　　 2．多序列同源比對和蛋白質結構預測分析表明，CAD1和 CAD3 之間同源性為54％，而兩者與CAD2 同源性比較低，僅為20％。只有CAD1和CAD3含有二者共有的3個保守的功能結構域：Zn1 結合位點[GHE(X)

4、2(X)5G(X)2V]，Zn2 結合位點 [GD(X)9.10C(X)2C(X)2C(X)7C]和 NADPH 輔酶結合位點[GXG(X)2G]；僅 CAD2 含有依賴于 NADPH的表異構酶/脫水酶家族的氧化還原酶功能結構域。進化樹分析結果表明，CAD1、CAD2和 CAD3分屬于 3個不同的家族。
　　 3．原核表達結果表明，CAD2基因表達的蛋白大部分是分布于上清的可溶性蛋白，分子量為53 kD，而 CAD1和CAD3基

5、因表達的蛋白皆形成包涵體，分子量分別為59 kD與56 kD。酶活測定結果發(fā)現(xiàn)，三個CAD基因表達的蛋白質具有不同的催化活性，其中以CAD2 活性最高，為0.43μmol·min 1·mg 1，CAD3 次之，為4.2nmol·min 1·mg 1，CAD1 最小，為3.8nmol·min 1·mg 1。CAD2的最適pH 為6，最適溫度為30℃，酶動力學參數(shù)Km 為1.974μmol·L 1，Vmax 為1.7437μmol·min

6、1·mg 1。
　　 4．利用Southern blot 技術分析發(fā)現(xiàn)，茶樹基因組中的CAD1和CAD2基因均以雙拷貝存在，而CAD3基因則是以單拷貝形式存在。
　　 5．茶尺蠖取食誘導3個CAD基因的表達量不盡相同，其中CAD1和CAD2間的誘導表達量的最大值差異不大，但是二者各自與CAD3的差別要明顯大于CAD1和CAD2 間的差異；三個基因的誘導表達量皆存在品種間差異，總體表現(xiàn)為舒茶早大于龍井43；從誘導表達規(guī)律上

7、來說，三個基因也存在差異，CAD1和CAD2表達量均是隨著取食后時間增加而緩慢增加，最大值分別出現(xiàn)在24 h和912h之間，而CAD3是先急劇增加至最大值，緊接著急劇下降，最大值則出現(xiàn)在36h 之間。而單獨的機械損傷處理后，三個基因間的最大表達量差異與茶尺蠖取食誘導的類似，但是品種間差異不顯著。通過外源激素誘導試驗發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）和脫落酸(ABA)處理均能誘導 3個 CAD基因的表達上調，但是三者各自的最大表