茶樹被茶尺蠖取食誘導(dǎo)的一個(gè)13-脂氧合酶基因的分離、功能鑒定與表達(dá)分析.pdf

1、茉莉酸（JA）是植物對(duì)害蟲取食誘導(dǎo)而產(chǎn)生直接防御的重要信號(hào)物質(zhì)，而脂氧合酶（LOX）是JA 合成的關(guān)鍵酶之一，因此有關(guān)植物L(fēng)OX 研究備受關(guān)注，然而茶樹體內(nèi)LOX的相關(guān)研究甚少。本論文以課題組前期獲得一條被茶尺蠖取食誘導(dǎo)表達(dá)，且可能為LOX基因的EST （GenBank：GW342753）為基礎(chǔ)，通過cDNA全長克隆、原核表達(dá)、高效液相色譜、熒光定量PCR對(duì)茶樹LOX的酶學(xué)特征和基因表達(dá)特征進(jìn)行研究。主要結(jié)果如下：
　　 （1）

2、通過cDNA末端快速克隆(RACE)方法獲得一條編碼茶樹LOX的全長cDNA序列，其開放閱讀框長度為2706 bp，編碼901個(gè)氨基酸，并命名為CsLOX3（GenBank：HM440161），且其理論分子量和等電點(diǎn)分別為101.84 kD與6.39 ；同源比對(duì)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)CsLOX3與已經(jīng)報(bào)道的茶樹的CsLOX2 同源性最高，為80％；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CsLOX3 含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，可能位于葉綠體，其保守功能區(qū)域有3個(gè)，且與Fe 3

3、+結(jié)合的活性位點(diǎn)有5個(gè)氨基酸，分別是His554，His559，His751，Asn755，Ile901。
　　 （2）原核表達(dá)分析表明，重組后CsLOX3 主要分布于此基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌裂解物上清中，SDS-PAGE 顯示其分子量為120 kD 左右。利用Co 2+-TALON Resin 樹脂進(jìn)行蛋白質(zhì)純化，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)酶學(xué)活性分析表明，CsLOX3 發(fā)揮酶活的最適溫度為45℃，此溫度下酶活力為(24.6 mmolmin-

4、1 mg-1）最適pH5.0，此pH下酶活力為(22.57 mmolmin-1 mg-1）；通過HPLC分析發(fā)現(xiàn)，原核表達(dá)的CsLOX3 酶促反應(yīng)只生成13-HPOT，因此屬于13S-LOX 類型。
　　 （3）qRT-PCR分析表明，CsLOX3基因在茶樹果實(shí)形成和開花初期表達(dá)量較低，而在成熟期和盛花期表達(dá)量皆上升到最大，分別為初期的16 倍與15.3 倍；CsLOX3基因在茶尺蠖取食后6-24 h 一直處于上調(diào)表達(dá)狀態(tài)，但是

5、不同品種表達(dá)規(guī)律不盡相同，上調(diào)表達(dá)的開始時(shí)間和最大表達(dá)量出現(xiàn)時(shí)間都是舒茶早品種較龍井43 晚，但是最大表達(dá)量相差不大，分別比對(duì)照高出10 倍與13.6 倍；機(jī)械損傷對(duì)其表達(dá)規(guī)律影響與茶尺蠖取食相近，只是品種間差異較大，表現(xiàn)為舒茶早的CsLOX3基因最大表達(dá)量要明顯大于龍井43，分別是各自對(duì)照的10.6 倍與3.6 倍；MeJA 處理龍井43后2d，CsLOX3基因表達(dá)量急劇升高至對(duì)照的17.3 倍，至4 d后又急劇下降，而對(duì)舒茶早影響不