與耐貯性相關(guān)的水稻脂氧合酶同工酶分析、OsLOX3的基因克隆以及一個(gè)脂氧合酶基因簇的結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、糧食安全是一個(gè)全球性的戰(zhàn)略問(wèn)題，而糧食貯備是其中重要的一環(huán)。已經(jīng)知道，稻谷在一般貯藏條件下第二年就會(huì)產(chǎn)生陳化變質(zhì)現(xiàn)象，隨著貯藏過(guò)程中溫度和濕度的提高，陳化過(guò)程也會(huì)迅速加快。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年我國(guó)因?yàn)殛惢瘑?wèn)題損失的包括作為食用和種子的稻谷占總產(chǎn)量的3％。近年來(lái)的研究表明，稻谷貯藏期間脂質(zhì)的降解是導(dǎo)致其品質(zhì)下降并產(chǎn)生令人不快氣味的主要原因之一，其中脂氧合酶(lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12)是脂質(zhì)降解的關(guān)鍵酶。因此從理論

2、上講，糧食作物L(fēng)OX的缺失可以明顯的阻止脂質(zhì)過(guò)氧化作用，減緩貯藏糧食氧化變質(zhì)的速度，保持清新氣味，提高耐貯性，上述推測(cè)已經(jīng)在水稻LOX的主要同工酶LOX-3的缺失體與耐貯性關(guān)系的研究中得到了初步證實(shí)，但是有關(guān)LOX-3缺失體的簡(jiǎn)單篩選方法、水稻種子LOX同工酶分析、LOX-3的基因克隆以及與缺失的關(guān)系還有待于進(jìn)一步的研究。 本文首先根據(jù)水稻種胚脂氧合酶-3共氧化的次生反應(yīng)特性及其催化產(chǎn)物的氧化特性，分別建立了篩選水稻種胚LOX-

3、3缺失體的胡蘿卜素漂白比色法和I2-KI，與常用的LOX-3單克隆抗體篩選技術(shù)相比，這兩種方法具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單且成本低的特點(diǎn)，可以進(jìn)一步用于耐儲(chǔ)藏水稻的分子育種研究。 采用生物化學(xué)的手段發(fā)現(xiàn)，水稻種子發(fā)育過(guò)程中的LOX同工酶多態(tài)性是非常豐富的，其中存在有分子量明顯小于68 kDa的LOX同工酶。根據(jù)不同的分離方法，水稻種子發(fā)育過(guò)程中的LOX同工酶至少是4-9條。與具有LOX-3活性的越光相比，采用梯度PAGE(5-20％)分

4、析發(fā)現(xiàn)，LOX-3缺少品種Daw Dam的LOX缺少譜帶分別屬于第一和第三類，而且至少有4條譜帶缺失；采用IEF(pH3.5-10)分析發(fā)現(xiàn)，DawDam種子成熟過(guò)程中明顯缺少pI為4.56的LOX同工酶(II)；采用Westem blotting分析也發(fā)現(xiàn)，LOX-3缺少品種Daw Dam的LOX缺少譜帶分別屬于兩大類。由于LOX-3缺少品種Daw Dam的LOX-3缺少并不是一個(gè)同工酶，而是缺少等電點(diǎn)較小的一類LOX，因此建議把種子

5、發(fā)育過(guò)程中的LOX同工酶劃分為L(zhǎng)OX-I類、LOX-II類和LOX-III類。 進(jìn)一步的免疫電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，越光和Daw Dam的種子發(fā)育進(jìn)程中，LOX蛋白并不出現(xiàn)在油體上，而是分布在蛋白貯藏囊泡(protein storage vacuole，PSV)的四周，因此與底物在空間上是分離的。但是在貯藏過(guò)程中，稻谷通常會(huì)自身發(fā)生細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和化學(xué)成分的改變，前者包括脂質(zhì)體的溶合、細(xì)胞膜完整性下降、透性增加和細(xì)胞溶質(zhì)功能的喪失。因此，也

6、會(huì)導(dǎo)致LOX與底物的靠近，啟動(dòng)LOX參與的脂質(zhì)過(guò)氧化，催化生成的脂氫過(guò)氧化物再被脂氫過(guò)氧化物裂解酶(hydroperoxide lyases，HPLs)和脂氫過(guò)氧化物異構(gòu)酶(hydroperoxide isomerases，HPIs)降解或自動(dòng)氧化為具有揮發(fā)性的己醛、戊醛和戊醇等羰基類低分子化合物，從而產(chǎn)生與稻米陳化變質(zhì)有關(guān)的陳米霉味。此外，也不排除LOX作為儲(chǔ)藏蛋白或合成傳遞生物脅迫和非生物脅迫信息信號(hào)分子的可能性。 進(jìn)一步克

7、隆并報(bào)道一個(gè)新的水稻種子脂氧合酶的編碼基因OsLOX3，該基因位于水稻第三染色體，并與OsLOX1/2呈基因簇排列。與OsLOX1/2相比，OsLOX3表達(dá)產(chǎn)物的等電點(diǎn)是最小的，其在染色體上的位置與本實(shí)驗(yàn)室耐貯性的QTL定位結(jié)果也是一致的。與OsLOX3相比，發(fā)現(xiàn)MiniOsLOX3在第四外元處存在有點(diǎn)突變，因此發(fā)生提前終止的現(xiàn)象，其原核表達(dá)產(chǎn)物的分子量為28 kDa，但是也具有一定的酶活性。最后，對(duì)位于水稻第三染色體的脂氧合酶基因簇進(jìn)