黃瓜全雌性相關(guān)的RAPD標(biāo)記及ACC合酶基因的克隆.pdf

1、黃瓜(Cucumis sativus L．)是葫蘆科重要的蔬菜作物，其性別表現(xiàn)復(fù)雜多樣，是研究植物性別決定和性別分化的良好實(shí)驗(yàn)材料。雌花發(fā)生的早晚及其分布狀態(tài)，即性型表現(xiàn)，與黃瓜成熟早晚、產(chǎn)量和品質(zhì)等有密切的關(guān)系。目前全雌性或強(qiáng)雌性是黃瓜優(yōu)勢(shì)育種的重要途徑。但由于黃瓜性別表現(xiàn)受到遺傳和環(huán)境等多種因素的影響，應(yīng)用傳統(tǒng)方法從表型上進(jìn)行全雌性基因的選擇效率不高。近年來(lái)，黃瓜的分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)日益受到研究人員的關(guān)注。它可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)育種方法的

2、不足，提高其準(zhǔn)確性，加速育種進(jìn)程。開(kāi)展DNA分子標(biāo)記研究是進(jìn)行黃瓜分子標(biāo)記輔助選擇育種、分離和克隆基因的基礎(chǔ)。 遺傳學(xué)分析表明，黃瓜的性別表型受3類(lèi)基因F、m、α的控制，其中F基因控制雌性表達(dá)。在幾類(lèi)植物激素中，生長(zhǎng)素、乙烯可強(qiáng)化植物的雌性表達(dá)，植株莖端乙烯的形成與雌花的分化存在很大相關(guān)性。由于ACC合酶是乙烯生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，因而ACC合酶在高等植物性別表達(dá)過(guò)程中的作用已受到人們的關(guān)注。許多研究者認(rèn)為ACC合酶基因與控制

3、黃瓜雌性的F位點(diǎn)存在緊密連鎖關(guān)系。 本文利用RAPD技術(shù)，篩選與黃瓜全雌性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，同時(shí)將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)換為特異性和穩(wěn)定性好的SCAR標(biāo)記，為實(shí)現(xiàn)黃瓜的早期性別鑒定與全雌性狀的分子輔助育種提供依據(jù)。另外，通過(guò)對(duì)ACC合酶基因的克隆和測(cè)序，試圖找到黃瓜不同品系中ACC合酶基因的差異，比較其與黃瓜不同性別表達(dá)類(lèi)型的關(guān)系，探討該基因在黃瓜性別決定過(guò)程中的作用。結(jié)果報(bào)告如下： (1)CTAB法提取黃瓜核基因組總DNA，采

4、用RAPD技術(shù)對(duì)39條隨機(jī)引物進(jìn)行初步篩選，其中有12條引物顯示多態(tài)性，以此作為篩選全雌性特異的分子標(biāo)記的候選引物。 (2)對(duì)多態(tài)性引物進(jìn)一步篩選，引物S10和S435可以在全雌系黃瓜中擴(kuò)增出兩條穩(wěn)定、清晰的特異條帶，大小約2000 bp和500 bp，分別記作S10-2 kb和S435-0.5 kb，而對(duì)照單株(雌雄同株)中不存在?？梢?jiàn)，這兩個(gè)分子標(biāo)記具有性型特異性。 (3)對(duì)S10-2 kb和S435-0.5 kb兩

5、個(gè)特異分子標(biāo)記進(jìn)行回收、克隆并測(cè)序，獲得全長(zhǎng)DNA序列，大小分別為2003 bp和470 bp。經(jīng)BLAST分析，發(fā)現(xiàn)S10-2 kb分子標(biāo)記與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的黃瓜序列同源性低，該片段可能為黃瓜中新發(fā)現(xiàn)的DNA序列；對(duì)S435-0.5 kb序列而言，所有的同源序列均與葫蘆科植物無(wú)關(guān)，該標(biāo)記系黃瓜中新發(fā)現(xiàn)的DNA序列。兩個(gè)分子標(biāo)記已提交GenBank注冊(cè)，序列號(hào)分別是EF 057801和EF 062502。ORF Finder分析表明，S1

6、0-2 kb序列含有最長(zhǎng)能編碼62個(gè)氨基酸的開(kāi)放讀框；而S435-0.5 kb序列，其最長(zhǎng)的ORF編碼68個(gè)氨基酸。以上兩個(gè)分子標(biāo)記編碼短肽的生理功能尚不確定，其生物學(xué)意義有待進(jìn)一步研究。 (4)依據(jù)2003 bp序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異引物(CSl和CS2)，將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。擴(kuò)增結(jié)果顯示，引物CSl在轉(zhuǎn)化過(guò)程中失去了多態(tài)性，而CS2能夠在全雌品系黃瓜中擴(kuò)增出目的條帶，雌雄同株黃瓜中卻不出現(xiàn)，表明成功轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記

7、，可作為黃瓜苗期性別鑒定的一對(duì)特異引物。 (5)根據(jù)已發(fā)表的ACC合酶基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)專一性引物，以全雌、強(qiáng)雌和弱雌性黃瓜品系為材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在全雌和強(qiáng)雌品系中獲得預(yù)期大小的DNA片段，而弱雌品系則不存在。經(jīng)克隆和測(cè)序分析，獲得全長(zhǎng)1042 bp的序列，比前人報(bào)道的序列長(zhǎng)1 bp，而最長(zhǎng)ORF編碼的氨基酸序列則完全一致；經(jīng)BLASTn檢索，發(fā)現(xiàn)與黃瓜CS-ACSl、CS-ACSlG基因同源性最高(同源性為85％左右)，初

8、步推斷該片段為ACC合酶基因(ACSG)。鑒于ACSG與雌性系表型之間存在一定的相關(guān)關(guān)系，ACSG基因可能是鑒定黃瓜雌性系的一個(gè)分子標(biāo)記。另外，可以檢索到與葫蘆科其他作物和薔薇科ACC合酶基因有較高同源性，與十字花科、豆科、茄科等植物的．ACC合酶基因具有低度的同源性。 結(jié)論：RAPD技術(shù)用于尋找黃瓜全雌性狀相關(guān)的分子標(biāo)記是可行的，在RAPD的基礎(chǔ)上將其轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記可提高M(jìn)AS的準(zhǔn)確性和效率。本文獲得的一對(duì)SCAR特異引物