小麥抗寒相關(guān)基因克隆及分子標(biāo)記開發(fā).pdf

1、低溫是限制小麥生長、發(fā)育以及分布的主要因素之一。寒害的發(fā)生經(jīng)常會導(dǎo)致小麥的嚴(yán)重減產(chǎn)，且一旦發(fā)生難于防控，通常只能依靠品種自身的抗性。因此增強(qiáng)小麥的抗寒性已經(jīng)成為育種工作者的首要目標(biāo)。植物的抗寒性是一個非常復(fù)雜的數(shù)量性狀，與冬春性相關(guān)聯(lián)又不完全緊密連鎖，盡管許多春化基因和抗寒位點(diǎn)被相繼報道，但真正能在分子育種生產(chǎn)實(shí)踐中被利用的卻很少。本研究擬克隆春化基因以外的抗寒相關(guān)基因，并根據(jù)序列間差異開發(fā)分子標(biāo)記，發(fā)掘優(yōu)異等位變異。取得以下主要結(jié)論:

2、
　　1、以小麥Wcs19基因的cDNA序列為基礎(chǔ)，通過基因步移技術(shù)克隆了抗寒小麥品種安農(nóng)0822中Wcs19基因的5'端上游1310 bp序列，利用啟動子PLACE和PlantCARE在線分析軟件分析發(fā)現(xiàn)該基因的5'端上游調(diào)控區(qū)除了含有典型的具有轉(zhuǎn)錄起始功能的TATA-box、CAAT-box外，還含有2個Cor基因保守的CRT/DRE元件。將基因步移獲得的Wcs19基因5'上游序列與Wcs19基因編碼區(qū)進(jìn)行拼接，共獲得一條長為

3、1920 bp的序列，并將其定位在小麥的2B染色體上。比較不同抗寒性品種間Wcs19基因的編碼區(qū)和上游調(diào)控區(qū)序列，雖然品種之間存在部分SNP，但是這些SNP與25份小麥材料的抗寒性并無相關(guān)性。
　　2、以小麥全基因組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，分別克隆了Wcor15位于小麥A、B、D基因組上的Wcor15-2A，Wcor15-2B和Wcor15-2D基因。并將其定位在小麥的第2部分同源染色體上。蛋白序列的分析表明，WCOR15-2A、WCOR1

4、5-2B和WCOR15-2D都屬于能定位到葉綠體的LEA3蛋白家族。比較不同抗寒性品種間Wcor15-2A，Wcor15-2B和Wcor15-2D基因的序列發(fā)現(xiàn):三個基因在不同抗寒性的小麥品種中序列是高度保守的，且保守性Wcor15-2A=Wcor15-2D＞W(wǎng)cor15-2B。
　　結(jié)合23個二倍體、10個四倍體和106個來自全國不同麥區(qū)的六倍體小麥材料，我們研究了保守基因Wcor15在小麥A、B、D基因組上的進(jìn)化，結(jié)果表明T

5、urartu可能是四倍體和六倍體小麥Wcor15-2A位點(diǎn)的供體，依次Ae.speltoides可能是四倍體和六倍體小麥Wcor15-2B位點(diǎn)的供體。Ae.tauschii的一個亞種Ae.tauschii ssp.strangulata是六倍體小麥Wcor15-2D的供體。通過序列比對，我們也發(fā)現(xiàn)在小麥兩次異源多倍化的過程中，A和D基因組上的Wcor15基因很穩(wěn)定沒有發(fā)生變異，B基因組上的Wcor15基因在小麥的第一次異源多倍化的過程中

6、就發(fā)生了變異。
　　3、以小麥全基因組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，克隆了Wcor14位于小麥A、B、D基因組上的Wcor14-2A、Wcor14-2B和Wcor14-2D基因，并將其定位在小麥的第2部分同源染色體上。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因的5'端上游調(diào)控區(qū)也含有Cor基因保守的CRT/DRE元件。在DNA水平，與Wcor14-2A和Wcor14-2D相比，Wcor14-2B基因在內(nèi)含子區(qū)多出了一段序列，三種序列間在DNA水平相似性＞83.6％

7、，在氨基酸水平相似性:＞97.9％。不同抗寒性品種中Wcor14-2A和Wcor14-2D序列無差異，而Wcor14-2B在品種間存在15個多態(tài)性位點(diǎn)包括14個SNP和1個6 bp的插入缺失。這15個多態(tài)性位點(diǎn)把Wcor14-2B分成了2種等位變異:Hap14a(缺失型）和Hap14b。比較Hap14a和Hap14b的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，發(fā)生在編碼區(qū)的多態(tài)性位點(diǎn)引起了不同單倍型間氨基酸序列的差異，包括2個氨基酸的插入和三個氨基酸的替換。依據(jù)

8、第一個外顯子中6 bp的InDel，開發(fā)了一對分子標(biāo)記14AF/14AR。該標(biāo)記與幼苗習(xí)性（冬春性）和苗期的抗寒性均顯著相關(guān)，且基因型Hap14a是一種優(yōu)異的等位變異。
　　4、以水稻BC1和玉米Bk2序列為參考，結(jié)合小麥全基因組數(shù)據(jù)庫，克隆了小麥TaCOBL在A、B、D基因組上的基因TaCOBL-5A、TaCOBL-5B和TaCOBL-5D，并將其定位在小麥的第5部分同源染色體上。通過對小麥全基因組數(shù)據(jù)庫的Blast，發(fā)現(xiàn)TaC

9、OBL-5在5BS上存在2個拷貝。TaCOBL-5A和TaCOBL-5D基因編碼449個氨基酸，TaCOBL-5B編碼450個氨基酸。聚類分析表明:小麥TaCOBL與水稻Bc1和玉米Bk2聚在一個分支上，它們氨基酸序列的同源性為84.6％，都含有COBRA蛋白家族保守的結(jié)構(gòu)域，因此推斷小麥的TaCOBL基因可能與水稻Bc1和玉米Bk2基因的功能相似，與纖維素的合成有關(guān)。不同抗寒性品種中TaCOBL-5A和TaCOBL-5D序列無差異，而