小麥組織培養(yǎng)再生相關(guān)基因克隆及分子特性分析.pdf

1、小麥組織培養(yǎng)高頻率植株再生是小麥細胞工程育種及轉(zhuǎn)基因研究的基礎(chǔ)。一直以來,從小麥生理及培養(yǎng)環(huán)節(jié)出發(fā),針對不同外植體、不同基因型進行再生性能的研究開展的比較深入,并取得了一定效果。相比之下,從分子角度進行再生性狀研究,利用分子生物學手段克隆和鑒定小麥再生相關(guān)候選基因,并借助基因工程技術(shù)進行轉(zhuǎn)小麥再生相關(guān)基因的功能研究相對緩慢。本研究綜合本課題組在此方面的研究基礎(chǔ),發(fā)明了一種高效誘導小麥幼胚植株再生的培養(yǎng)方法；同時根據(jù)已有的文獻報道及mRN

2、A差別雜交結(jié)果,克隆到3類與小麥組織培養(yǎng)再生相關(guān)的候選基因,并對其進行了相關(guān)分子生物學功能鑒定,取得了如下主要結(jié)果:
　　 1.以小麥基因型中8601幼胚為試驗材料,進行2,4-D中斷(培養(yǎng)在SD0培養(yǎng)基上)及不中斷(培養(yǎng)在SD2培養(yǎng)基上)培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)預培養(yǎng)8 d和2,4-D中斷培養(yǎng)12 d處理顯著提高小麥幼胚的再生能力,植株再生率由12.3％提高到208.2％。該方法適用于不同小麥基因型幼胚培養(yǎng),一定程度減弱了小麥幼胚培養(yǎng)的基因

3、型依賴性。另外,還發(fā)現(xiàn)溫度和水分脅迫條件下生長的供體植株對小麥幼胚再生率影響明顯。
　　 2.利用同源克隆方法,首次分離到小麥中亞硝酸還原酶編碼基因TaNiR。BiFC分析表明,小麥TaNiR能夠與鐵氧還蛋白(Fd)互作。定量分析表明,小麥TaNiR表達受到KNO3誘導,胚性愈傷組織較非胚性愈傷組織表達量高。TaNiR表達也受到不同溫度預處理和SD0處理的誘導。TaNiR定位表明,在小麥染色體6A和6B上各存在1個拷貝,進一步將

4、TaNiR的1個拷貝定位于染色體6BL。啟動子功能元件缺失分析表明,TaNiR啟動功能較弱,其中,PNiR4區(qū)段包含TaNiR的第1個內(nèi)含子,其調(diào)控功能相比其他3個片段略強。轉(zhuǎn)基因功能驗證,初步表明TaNiR對小麥再生有一定作用。
　　 3.通過篩選已報道的mRNA差別雜交結(jié)果,篩選到過氧化氫酶基因CAT,并克隆到小麥TaCAT3。根據(jù)第2個內(nèi)含子序列,發(fā)現(xiàn)小麥TaCAT3存在3種類型。TaCAT2啟動子序列區(qū)域存在一段類似Ta

5、CAT3第2個內(nèi)含子插入機制的插入缺失突變。TaCAT1啟動子功能元件缺失分析表明,TaCAT1啟動子的啟動功能較弱。定量分析表明,SD0、25℃培養(yǎng)條件、供體植株水分脅迫處理、低濃度BR對TaCATs表達具有誘導作用,同時誘發(fā)小麥愈傷組織中H2O2累積。轉(zhuǎn)基因功能分析表明,TaCAT1-RNAi轉(zhuǎn)化對KN199愈傷組織再生有一定抑制效果。
　　 4.克隆到3個小麥體細胞胚胎發(fā)生受體蛋白激酶基因SERKs,其中2個為全長序列(T

6、aSERK1N,TaSERK3N)。序列及表達特性分析表明,TaSERK1N與TaSERK2N編碼產(chǎn)物、蛋白高級結(jié)構(gòu)十分相似。3個TaSERKsN在幼胚及胚性愈傷組織中表達量最高,在愈傷組織誘導階段變化明顯。水分脅迫、25℃預處理、AGP及BR處理能誘導TaSERKsN表達。染色體定位預測表明,TaSERK1N與TaSERK2N都位于小麥第2號染色體上,而TaSERK3N則可能位于第4號染色體或第5號染色體長臂的某個區(qū)域。