小麥與條銹菌互作相關(guān)基因的克隆與特性分析.pdf

1、由小麥條銹菌(Puccinia striiformis f．sp．tritici)引起的小麥條銹病是小麥生產(chǎn)上的一個(gè)重要病害，挖掘抗病基因培育抗病新品種是防治小麥條銹病的最有效途徑。本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建了小麥品種水源11與條銹菌生理小種CY31親和互作的抑制性差減雜交文庫(kù)，并獲得大量差異表達(dá)基因，本研究從中挑選了3個(gè)基因進(jìn)行初步功能分析。 本研究首先在本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的親和互作cDNA文庫(kù)中篩選基因全長(zhǎng)，未得到全長(zhǎng)序列的基因再通過(guò)電子克隆

2、或RACE進(jìn)行延伸克隆。采取小麥品種水源11接種條銹菌生理小種CY31(親和互作)與CY23(非親和互作)后0h、12h、18h、24h、48h、72h、120h的小麥葉片，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為Real-time RT-PCR模板，對(duì)基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，并做了有關(guān)基因的原核表達(dá)及構(gòu)建VIGS體系。具體如下： 1小麥過(guò)氧化物還原酶(Peroxiredoxin，Prx)基因，命名為T(mén)aPrx，根據(jù)已知EST序列設(shè)

3、計(jì)引物，在cDNA文庫(kù)中篩選得到其全長(zhǎng)序列688bp，ORF489bp，編碼162個(gè)氨基酸殘基。TaPrx與水稻和擬南芥Ⅱ類(lèi)Prx相似性分別為84％和76％，6-160aa為PRX5保守結(jié)構(gòu)域。編碼蛋白分子量17.36kDa，等電點(diǎn)5.32，含有一個(gè)保守的半胱氨酸殘基，不含信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)94％的可能性存在于細(xì)胞質(zhì)。原核表達(dá)的融合蛋白分子量38kDa，Westem blot結(jié)果顯示制備的抗體能與抗原特異性結(jié)合。Real

4、-timeRT-PCR分析表明TaPrx基因在小麥與條銹菌的親和與非親和互作中均受誘導(dǎo)表達(dá)，分別在接種后24h，18h達(dá)到表達(dá)高峰，與ROS的表達(dá)模式基本一致，即均在24h前達(dá)到表達(dá)高峰，表明TaPrx基因與ROS的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，TaPrx基因可能參與了小麥?zhǔn)軛l銹菌侵染后產(chǎn)生的ROS的清除與調(diào)節(jié)從而在抗病性中起作用。 2小麥吞噬遷移蛋白(engulfment and cell motility protein，ELMO)基因，命

5、名為T(mén)aELMO，利用篩選cDNA文庫(kù)與電子克隆結(jié)合獲得TaELMO基因的全長(zhǎng)序列1155bp，ORF810bp，編碼269aa，編碼蛋白分子量30.657kDa，等電點(diǎn)5.51，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)91％的可能性存在于細(xì)胞質(zhì)，不含信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域。Real-time RT-PCR．分析表明TaELMO基因在小麥?zhǔn)軛l銹菌誘導(dǎo)后呈下調(diào)表達(dá)。 3小麥中與玉米葉片壞死斑點(diǎn)(lethal leaf-spot1，Lls1)同源基因，命名為T(mén)a