小麥與葉銹菌互作體系中TaHIR2基因克隆及其特性分析.pdf

1、過(guò)敏性反應(yīng)(Hypersensitive Response,HR)是植物抗病機(jī)制中最常見(jiàn)的一種抗病表現(xiàn)形式。過(guò)敏性誘導(dǎo)反應(yīng)蛋白是參與植物HR過(guò)程的一類蛋白。目前在小麥上尚未見(jiàn)TaHIR2的報(bào)道。為明確TaHIR2及其所編碼蛋白在小麥中的存在狀況及其與小麥抗葉銹病性的關(guān)系,本研究以受葉銹菌侵染的小麥抗葉銹病近等基因系TcLr15為材料,利用PCR技術(shù)克隆獲得小麥過(guò)敏性誘導(dǎo)反應(yīng)蛋白2(TaHIR2)的cDNA及基因組DNA序列；利用實(shí)時(shí)定量

2、PCR(qRT-PCR)技術(shù)對(duì)小麥與葉銹菌親和及非親和互作過(guò)程中TaHIR2的表達(dá)模式進(jìn)行了分析；通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體對(duì)該基因進(jìn)行原核表達(dá),產(chǎn)生的蛋白用于制備抗體,利用Western雜交技術(shù)對(duì)小麥中該基因所編碼蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)；構(gòu)建了含有TaHIR2基因的重組質(zhì)粒,通過(guò)基因槍介導(dǎo)法分別對(duì)小麥品種TcLr15和Thatcher的成熟胚性愈傷組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。主要內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面:
　　 1.小麥TaHIR2基因克隆及序列分

3、析。以小麥抗葉銹病近等基因系TcLr15和非親和葉銹菌株05-19-43②為材料,以接菌24 h、48 h和72 h小麥葉片總RNA的等量混合物為模板,通過(guò)RT-PCR技術(shù)獲得小麥TaHIR2的cDNA序列。同時(shí)以TcLr15的基因組DNA為模板,通過(guò)PCR技術(shù)獲得TaHIR2的DNA序列。
　　 2.小麥TaHIR2B寸空表達(dá)模式分析。以接種非親和葉銹菌05-19-43②和親和葉銹菌05-5-137③的小麥TcLr15葉片為材

4、料,應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)接種不同毒力葉銹菌后小麥葉片中TaHIR2的時(shí)間表達(dá)模式。結(jié)果表明TaHIR2受葉銹菌誘導(dǎo)18 h時(shí)表達(dá)量均上升,在接種36 h時(shí)達(dá)到最大,然后下降。但在非親和組合中,24 h和36 h的表達(dá)量要明顯高于親和組合。以小麥TcLr15的幼根、幼莖、幼葉和種子為材料,應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)TaHIR2在這幾種組織中的表達(dá)量差異。結(jié)果表明TaHIR2在小麥幼葉中的表達(dá)量最大。
　　 3.TaHIR2蛋

5、白在葉銹菌侵染不同時(shí)間點(diǎn)的小麥葉片中表達(dá)模式分析。將TaHIR2基因的編碼區(qū)插入到表達(dá)載體pET-30(+)中,獲得原核表達(dá)載體TaHIR2-pET-30a,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)。對(duì)陽(yáng)性菌株的蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為0.3 mM,最佳誘導(dǎo)時(shí)間為7 h。表達(dá)的融合蛋白分子量為37 kDa左右,該蛋白存在于包涵體中。用Ni2+-His親和層析柱對(duì)蛋白進(jìn)行純化后,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)呈

6、現(xiàn)單一條帶。純化的蛋白用于免疫兔子,制備抗體,當(dāng)效價(jià)達(dá)到1:76800時(shí),利用Western雜交檢測(cè)抗體質(zhì)量,并對(duì)小麥中TaHIR2蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。雜交結(jié)果表明,在小麥中確實(shí)存在TaHIR2蛋白。對(duì)葉銹菌侵染不同時(shí)間點(diǎn)的小麥葉片中TaHIR2蛋白的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明在非親和組合中,TaHIR2蛋白的表達(dá)量在檢測(cè)的時(shí)間進(jìn)程中平穩(wěn)增長(zhǎng),60 h時(shí)達(dá)到最大,而在親和組合中,蛋白的表達(dá)量在96 h時(shí)達(dá)到最大。
　　 4.

7、TaHIR2基因植物高效表達(dá)載體構(gòu)建及再生小麥幼苗獲得。將TaHIR2基因的編碼區(qū)定向插入到載體pAHC-25中,獲得重組質(zhì)粒TaHIR2-pAHC-25,利用基因槍介導(dǎo)法將該重組載體轉(zhuǎn)化小麥品種TcLr15和Thatcher的成熟胚性愈傷組織,經(jīng)分化篩選后獲得再生的小麥幼苗。
　　 本研究在克隆獲得小麥TaHIR2 cDNA及基因組DNA序列基礎(chǔ)上,利用實(shí)時(shí)定量、Western雜交及轉(zhuǎn)基因等技術(shù)對(duì)TaHIR2基因進(jìn)行系統(tǒng)研究,