小麥-葉銹菌互作體系激發(fā)子的分離純化及cDNA-AFLP分析.pdf

1、近年來的研究表明,寄主與病原物互作表現(xiàn)感病還是抗病,不單取決于防衛(wèi)反應(yīng)的有無(wú),更在于防衛(wèi)反應(yīng)表達(dá)的時(shí)間、空間和強(qiáng)度上的差異.寄主與病原物的相互識(shí)別是誘發(fā)防衛(wèi)反應(yīng)的第一步,因此對(duì)識(shí)別的原初信號(hào)分子-激發(fā)子(elicitor)的研究日益受到重視.已經(jīng)證明,小麥-葉銹菌互作,無(wú)論親合互作還是不親合互作的細(xì)胞間隙液(intercellular washing fluids,IWF)中都有激發(fā)子的存在.該試驗(yàn)采用小麥抗葉銹近等基因系TcLr19和

2、Thatcher,與葉銹菌生理小種99-5-49-4組成親和程度不同的組合.不親和組合(TcLr19×99-5-49-4)于接種后第三天,親和組合(Thatcher×99-5-49-4)于接種后第五天,用真空滲入重蒸餾水法提取IWF,分別記作IWFt9和IWFTh,同時(shí)以不接菌的健葉提取的IWF作為對(duì)照,分別記作IWFCK1和IWFCK2.IWF經(jīng)硫酸銨粗沉淀后,將蛋白沉淀用重蒸水重新溶解后進(jìn)行凝膠過濾柱層析,以280nm紫外吸收檢測(cè)、

3、收集不同的蛋白峰,分別注射到健康的Thatcher葉片中,以苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)、過氧化物酶(peroxidase,PO)防衛(wèi)反應(yīng)作為評(píng)價(jià)誘導(dǎo)活性的指標(biāo),檢測(cè)活性成分(激發(fā)子)在各部分中的分布和誘導(dǎo)活性的強(qiáng)弱.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:不同親和性來源的IWF經(jīng)凝膠過濾柱層析后,活性強(qiáng)度具有一定的差異.親和組合的收集峰1(P1)、收集峰2(P2)誘導(dǎo)活性比較高,而收集峰3(P3)組分則對(duì)PAL

4、活性表現(xiàn)出抑制作用;不親和組合的收集峰1(P1)對(duì)PAL酶誘導(dǎo)活性比較高.利用RNA水平上的表達(dá)差異同樣可以檢測(cè)寄主與病原物互作的情況.該試驗(yàn)將上述試驗(yàn)體系,即TcLr19×99-5-49-4(不親和組合)和Thatcher×99-5-49-4(親和組合),于接種后12h,24h,36h,48h,60h,72h和120h分別剪取接菌小麥葉片和健康對(duì)照,提取葉片組織總RNA,利用與mRNA5端互補(bǔ)的錨定引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過cDNA-