cDNA-AFLP分析大豆與尖孢鐮刀菌互作中基因表達(dá)圖譜.pdf

1、大豆根腐病(Soybeanrootrot)是一種分布廣、危害嚴(yán)重和防治較困難的世界性病害。近年來隨著大豆面積的不斷增加，大豆重迎茬狀況日益加劇，使大豆根腐病的危害逐年加重，對(duì)產(chǎn)量的影響越來越大。尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)是大豆根腐病的主要致病菌。關(guān)于大豆根腐病的研究多集中于病理學(xué)方面，大豆與尖孢鐮刀菌互作分子機(jī)制未見報(bào)道，但是理解二者間的分子互作機(jī)制有助于對(duì)大豆根腐病的研究和防治。本試驗(yàn)就是從轉(zhuǎn)錄水平研究大豆與尖孢

2、鐮刀菌的互作機(jī)理。 本文以cDNA-AFLP技術(shù)研究大豆與尖孢鐮刀菌親和性互作中大豆的轉(zhuǎn)錄圖譜。用浸根法接種尖孢鐮刀菌于大豆根部，以未接種的大豆根作為對(duì)照。分別在互作0d、2d、4d和8d后剪取接種和未接種的大豆根，然后提取大豆根部總RNA和mRNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)分析。cDNA-AFLP操作中選擇識(shí)別6個(gè)堿基位點(diǎn)的AseI和識(shí)別4個(gè)

3、堿基位點(diǎn)的TaqI對(duì)雙鏈cDNA進(jìn)行限制性酶切，得到的兩種粘末端分別連接上兩種人工接頭，預(yù)擴(kuò)增一次后再用64對(duì)2+2選擇性引物擴(kuò)增并在聚丙烯酰胺凝膠電泳后用銀染方法染色進(jìn)行指紋圖譜分析。 結(jié)果表明：凝膠電泳顯示的條帶可分為4類：①在整個(gè)侵染過程中一直存在，而且未接種植物中也存在，這些片段是來自于植物。②一些片段在接種0-4d內(nèi)處理均出現(xiàn)，在接種后8d表達(dá)量下降或不表達(dá)，而在對(duì)照中一直表達(dá)；還有一些在接種0天的處理中出現(xiàn)，在接種2

4、-8d內(nèi)表達(dá)量下降或不表達(dá)，而在對(duì)照中一直表達(dá)，這些片段可能是來自于植物。③一部分片段在接種0d的RNA樣品中存在，在接種2-4d后消失，然后又開始積累，這些片段可能來自于尖孢鐮刀菌；還有一部分條帶只有在侵染后期才出現(xiàn)，這些片段大部分可能來自于病原菌，還有一些是來自于植物。這些來源于植物的基因一部分可能是由于受到尖孢鐮刀菌的侵染而被誘導(dǎo)表達(dá)。④大豆在被尖孢鐮刀菌侵染過程中沒有出現(xiàn)，而在對(duì)照中出現(xiàn)的條帶。這些基因可能是因?yàn)榧怄哏牭毒a(chǎn)生抑

5、制子而抑制其表達(dá)。 經(jīng)分析后共獲得差異片段16條，其中屬于上調(diào)的有9條，下調(diào)的有7條。16條差異片段均送到生物公司測(cè)序。8條片段在數(shù)據(jù)庫中找到同源序列，其中6條是已知功能的基因片段，其余的10條功能未知。序列同源性分析表明：S-7與大豆種衣BURP區(qū)域蛋白1基因有84％同源性；S-5與編碼菜豆鈣調(diào)素結(jié)合蛋白的基因有86％的同源性；S-19與白羽扇豆羥基多花堿-羥基烷寧轉(zhuǎn)移酶有80％同源性，對(duì)S-5進(jìn)行克隆并獲得重組質(zhì)粒。