文心蘭花發(fā)育相關(guān)基因的cDNA-AFLP差異顯示及表達(dá)分析.pdf

1、植物開(kāi)花過(guò)程是高等植物生活史中非常重要的一環(huán)，受環(huán)境信號(hào)和植物體內(nèi)部信號(hào)的共同調(diào)節(jié)。對(duì)植物花發(fā)育相關(guān)生理和分子生物學(xué)進(jìn)行研究已是近20多年來(lái)植物生理學(xué)和植物生物學(xué)的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，植物開(kāi)花過(guò)程可分為三個(gè)階段：開(kāi)花決定、花的發(fā)端、花器官形成和發(fā)育。LFY(LEAFY)基因在花發(fā)育的三個(gè)階段都起著重要的調(diào)節(jié)作用，它處于花發(fā)育相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心位置。蔗糖被發(fā)現(xiàn)能夠通過(guò)影響LFY基因的激活而促進(jìn)或延后開(kāi)花。cDNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)

2、性(cDNA-AFLP)技術(shù)是一種高通量、基因組規(guī)模的轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)。
　　本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定的cDNA-AFLP實(shí)驗(yàn)體系，發(fā)現(xiàn)利用TRIzol法提取總RNA，利用EcoRⅠ和MseⅠ將cDNA酶切3 h，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋15倍作為選擇性擴(kuò)增模板，可以獲得重復(fù)性較好的cDNA-AFLP指紋圖譜。通過(guò)引物篩選獲得了114對(duì)適合于文心蘭cDNA-AFLP分析的選擇性擴(kuò)增引物。
　　依據(jù)建立的cDNA-AFLP分析體系，

3、對(duì)文心蘭Oncidium‘Milliongolds’花芽發(fā)育過(guò)程中的差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析。利用114對(duì)引物，總共獲得了約15960條TDFs。對(duì)其中1248條進(jìn)行回收、克隆和測(cè)序，得到了993條可讀序列。BLASTX/N同源性比對(duì)分析所有獲得的序列，發(fā)現(xiàn)80％以上的TDFs都能夠在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到功能已知的同源序列。其中281條已提交至dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)，GenBank登陸號(hào)為JG014357~JG014634。依據(jù)比對(duì)分析的結(jié)果將測(cè)序獲得

4、的TDFs歸入不同的功能類型，主要包括代謝(16.7%)、基因表達(dá)調(diào)控(7.3%)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(4.4%)、能量(1.4%)和物質(zhì)運(yùn)輸(1.5%)等。
　　利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法克隆了文心蘭SUS1(SUCROSE SYNTHASE1)和LFY基因的全長(zhǎng)mRNA序列，GenBank登陸號(hào)分別為JF416946和HM358866。文心蘭SUS1和LFY基因開(kāi)放閱讀框分別長(zhǎng)2448 bp和1125 bp。序列分析發(fā)現(xiàn)它們與蝴

5、蝶蘭、莫氏蘭等蘭科植物中相應(yīng)基因的同源性最高，而且與單子葉植物中相應(yīng)基因的同源性高于其與雙子葉植物中相應(yīng)基因的同源性。
　　對(duì)SUS1、LFY和PFT1(PHYTOCHROME AND FLOWERING TIME PROTEIN1)進(jìn)行了定性和熒光定量表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SUS1和LFY基因的表達(dá)模式非常相似，而PFT1表達(dá)模式與前二者不同。為探索SUS1基因在花發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮的功能，測(cè)定了不同組織中糖類物質(zhì)的含量和蔗糖合成