基于cDNA-AFLP技術的與紅花品質相關基因的篩選及克隆.pdf

1、紅花(Carthmus tinctorius L.)為菊科植物紅花的干燥管狀花,具有擴張冠狀動脈、抗凝、降血壓、抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理作用,臨床應用廣泛。其中黃酮類查爾酮成分-羥基紅花黃色素A(HSYA)是紅花的主要活性成分,而羥基紅花黃色素A含量的高低,直接影響紅花品質的優(yōu)劣。對紅花品質相關功能基因進行研究,對提高紅花的產量和質量具有重要意義。 本研究采用HPLC法,對紅花親本及雜交F1及F2代植株的羥基紅花黃色素A含量進行綜合分

2、析的結果表明,F1代各植株均含羥基紅花黃色素A,卡方檢驗得F2代各植株含HSYA不含HSYA的比例為3:1(x2=1.36(x20.05=3.84,x2

3、數為10倍；選擇性擴增最佳稀釋倍數為150倍；PAGE電泳得到清晰,穩(wěn)定、分辨率較高的多態(tài)性條帶。繼而采用紅花采用分群分類策略(BSA),以F2代含羥基紅花黃色素A與不含羥基紅花黃色素A的極端值為依據,構建了品質性狀的兩個近等基因池。應用cDNA-AFLP差異表達分析技術,從表達水平篩選與羥基紅花黃色素A相關的基因片段(TDF)。在基因池中反復篩選,從256對引物中得到條帶多且清晰的適合紅花的132對引物組合。經過基因池、親本及F2代單

4、株的共同驗證,篩選出具有特異性多態(tài)性的兩組引物(EcoRI-CA/MseI-GA、EcoRI-TT/MseI-TC),最終獲得3條與紅花高品質性狀(含HSYA)緊密連鎖的特異性TDF片段,分別命名為TDF-8、TDF-9、TDF-27,他們的遺傳距離為9.2 cM、6.8 cM、8.0 cM。經測序,這3條片段的精確長度分別為450bp、118bp、282bp,GenBank登陸號依次為EU567303,EU567305和Eu56730

5、4。3條片段的RT-PCR表達分析驗證了cDNA-AFLP的準確性。生物信息學分析發(fā)現,這3條基因片段與蠶豆萎蔫病毒和綠葉刺蕊草花葉病毒基因高度同源(>85％),推測羥基紅花黃色素A可能是由于外界病毒對紅花的侵染引發(fā)應激作用以抵御病毒而產生抗性的結果,該病毒基因插入并整合到含羥基紅花黃色素A的紅花品種基因組,世代演化并穩(wěn)定遺傳下來。從進化理論進一步支持了本研究獲得的3條特異性TDF片段與羥基紅花黃色素A的產生密切相關的研究結果。本研究成