尖孢鐮刀菌突變體庫的構建及致病相關基因分析.pdf

1、農(nóng)桿菌遺傳介導轉(zhuǎn)化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT)是獲得絲狀真菌突變體的有效方法之一，并得到廣泛應用。尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是引起河北省蘋果再植病害的一種重要致病菌，為了解其生長發(fā)育以及分子致病機制。本研究采用農(nóng)桿菌介導的T-DNA插入突變技術，對尖孢鐮刀菌HS2菌株進行遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化，以期獲得轉(zhuǎn)化效率較高的轉(zhuǎn)化體系，從而建立

2、尖孢鐮刀菌的T-DNA插入突變體庫，并對部分突變體的生長速率、產(chǎn)孢能力、致病力、插入拷貝數(shù)以及插入位點側(cè)翼序列進行了分析研究，主要結(jié)果如下:
　　1.用攜帶綠色熒光蛋白、卡那霉素抗性基因以及潮霉素抗性基因標記的質(zhì)粒pCamhybgfp的農(nóng)桿菌LBA4404菌株對尖孢鐮刀菌HS2進行農(nóng)桿菌遺傳介導轉(zhuǎn)化，并對影響轉(zhuǎn)化效率的共培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，所得到的遺傳轉(zhuǎn)化體系:將9mL濃度為106個/mL尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液與等體積的OD600

3、≈0.3的農(nóng)桿菌LBA4404混合，取200μL混合液在含有200μmol/mL乙酰丁香酮(AS)的IM固體培養(yǎng)基進行19-22℃，48h的共培養(yǎng)。利用這一體系，每106個分生孢子能產(chǎn)生160-200個轉(zhuǎn)化子。
　　2.利用以上優(yōu)化的轉(zhuǎn)化體系，建立了包含2440個突變體的突變體庫。對其中300個突變體進行了PCR鑒定，并用熒光顯微鏡對突變體進行綠色熒光觀察，其中283個突變體含有1000bp左右的目的條帶并伴有綠色熒光，T-DNA

4、整合效率達到94.33％。在對283株突變體進行遺產(chǎn)穩(wěn)定性實驗測定中，經(jīng)過在PDA上5代繼代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)突變體仍可以在含潮霉素B的PDA上正常生長，證明外源基因已經(jīng)插入到HS2基因組中并且能夠穩(wěn)定遺傳。
　　3.對遺傳穩(wěn)定的突變體進行形態(tài)學、生長速率、產(chǎn)孢能力和致病力分析。與野生菌株HS2相比，在對223株突變體的致病力測定中，大部分突變體致病力變?nèi)酰渲型蛔凅wHS2-2109基本喪失致病力。從致病力缺失的突變體中，選取8株突變體進

5、行Southern雜交分析，結(jié)果顯示其中6株突變體為單拷貝插入，1株為雙拷貝插入。
　　4.利用熱不對稱嵌套PCR(TAIL-PCR)對產(chǎn)孢量和致病力下降且為單拷貝插入的突變體分別進行了側(cè)翼序列擴增，共獲得了3條側(cè)翼序列。經(jīng)過分析，其中突變菌株HS2-100的右翼序列與尖孢鐮刀菌假定蛋白的mRNA序列同源，HS2-100的左翼序列與層出鐮刀菌D02945的des基因、P450-4基因和P450-1基因為同源序列，HS2-1107左

6、翼序列與構巢曲酶FGSCA4c的Ⅷ染色體的2848590-2848704nt區(qū)域序列同源，而這3條基因的功能都需要進一步研究。
　　5.重測序結(jié)果表明突變菌株HS2-520T-DNA的插入位點在基因組的45604-45615nt處，該位置的基因未有功能注釋，所編碼的蛋白為假定蛋白FOC4_g10004604。突變菌株HS2-406T-DNA的插入位點在基因組的564331-564434nt處，該位點的上游基因為asp1基因，所編碼

7、的蛋白是二磷酸肌醇多磷酸水解酶aps1，位點為559622-563280nt處;它的下游為未知基因，所編碼的蛋白是假定蛋白FOXB_06474，位點在566624-567793nt處。突變體HS2-2109T-DNA的插入位點在基因組的813838-814852nt處，它的上游基因是KIN4，所編碼的蛋白是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶KIN4，位點在809998-813406nt處;它的下游基因是GWT1，所編碼的蛋白是糖基磷脂酰肌醇-錨定壁