大麗輪枝菌致病相關(guān)突變體的篩選及致病基因VdCYP1功能初步研究.pdf

1、黃萎病是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）引起的土傳性維管束病害。在我國(guó)，黃萎病已經(jīng)成為棉花生產(chǎn)的主要障礙。棉花黃萎病難以防治，主要原因是其病原菌致病機(jī)理復(fù)雜，因此，鑒定大麗輪枝菌致病相關(guān)基因，闡明其致病機(jī)理已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。
　　農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法在功能基因組學(xué)中發(fā)揮著重要作用，是分離鑒定新基因的有效方法。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法獲得了高致病力大麗輪枝菌Vd991的T-DNA

2、隨機(jī)插入突變體15131個(gè)。傳統(tǒng)溫室黃萎病菌致病性鑒定方法已經(jīng)用于大麗輪枝菌致病相關(guān)突變體的篩選，但效率偏低，遠(yuǎn)不能滿足致病相關(guān)突變體的篩選與鑒定研究。因此，建立快速、高通量致病性鑒定方法對(duì)于大麗輪枝菌致病相關(guān)突變體的篩選至關(guān)重要。
　　本研究首先明確了引起棉花黃萎病癥狀的孢子濃度為大于5.0×105個(gè)孢子/mL;建立了大麗輪枝菌的標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)方法，簡(jiǎn)化了孢子懸浮液制備過(guò)程;優(yōu)化了單孢分離、擴(kuò)大培養(yǎng)、孢子懸浮液制備、接種、繼續(xù)培養(yǎng)和

3、結(jié)果統(tǒng)計(jì)等環(huán)節(jié)，建立了大麗輪枝菌致病性快速鑒定流程，進(jìn)一步統(tǒng)籌設(shè)計(jì)構(gòu)建了大麗輪枝菌致病相關(guān)突變體快速篩選體系。運(yùn)用構(gòu)建的快速篩選體系對(duì)1344個(gè)T-DNA插入突變體進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)69個(gè)突變體致病力明顯下降，16個(gè)突變體致病力顯著下降或喪失;(2)通過(guò)傳統(tǒng)菌液蘸根法群體驗(yàn)證出6個(gè)突變體對(duì)軍棉1號(hào)致病力均明顯下降;(3)通過(guò)Dps統(tǒng)計(jì)軟件分析病情指數(shù)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)致病力幾乎喪失的突變體M01 C06和M01E10。利用hiTAIL-

4、PCR方法擴(kuò)增到突變體M01A06、M01 C06、M03B07和M04H05插入位點(diǎn)右側(cè)序列。
　　通過(guò)測(cè)序和BLAST分析，發(fā)現(xiàn)突變體M01 C06的T-DNA插入點(diǎn)位于第四條染色體上基因VDAG05889和VDAG_05890之間。VDAG_05889編碼蛋白預(yù)測(cè)為翻譯起始因子5，VDAG_05890編碼蛋白預(yù)測(cè)為細(xì)胞色素P4503A13，分別命名為VdIF5和VdC YP1。通過(guò)定量PCR方法分析VdIF5和VdC YP1

5、基因的表達(dá)水平，VdC YP1基因表達(dá)量顯著下降，推測(cè)出了影響M01C06致病力的基因?yàn)閂dCYP1。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法獲得了VdCYP1基因缺失突變體，經(jīng)過(guò)產(chǎn)孢量檢測(cè)、表型鑒定和致病力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)(1)ΔVdC YP1缺失突變體和突變體M01C06生長(zhǎng)速率及生長(zhǎng)表型無(wú)變化;(2)ΔVdCYP1缺失突變體和突變體M01 C06產(chǎn)孢能力和致病力顯著下降。證明了突變體M01C06致病力的下降是由于T-DNA插入影響了VdC YP1基因

6、的表達(dá)，VdCYP1是大麗輪枝菌致病相關(guān)基因。
　　克隆了VdCYP1基因全長(zhǎng)序列，基因組序列長(zhǎng)1767bp，cDNA序列長(zhǎng)1458bp，編碼氨基酸485個(gè)，5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子。通過(guò)SMART和TMHMM2.0軟件預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)VdC YP1基因含有跨膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞色素P450保守結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)該基因功能主要與真菌次級(jí)代謝物合成及致病力相關(guān)。定量PCR分析表明大麗輪枝菌侵染棉花組織過(guò)程中VdCYP1接種后1-3天內(nèi)被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，表

7、明VdCYP1基因與大麗輪枝菌侵染過(guò)程初期密切相關(guān)。構(gòu)建了VdCYP1過(guò)表達(dá)載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到突變體M01C06和缺失突變體ΔVdCYP1中，構(gòu)建了突變體M01C06的過(guò)表達(dá)菌株和突變體ΔVdC YP1的功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子。致病力鑒定表明，過(guò)表達(dá)菌株和功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子致病力顯著提高，病情指數(shù)分別達(dá)到60.11±1.94和62.49±3.13，與野生型菌株致病力(病情指數(shù)為68.05±3.62)相似，初步證明了細(xì)胞色素P4