大麗輪枝菌微菌核發(fā)育異常突變體的篩選及其相關(guān)基因的鑒定.pdf

1、為了更加深入的分析研究大麗輪枝菌微菌核發(fā)育相關(guān)基因的功能，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(ATMT)方法，成功構(gòu)建了大麗輪枝菌菌核型菌株V08DF1、中間型菌株VBp2的突變體庫(kù)，其中產(chǎn)生大量黑色微菌核的V08DF1庫(kù)中包含2000個(gè)轉(zhuǎn)化子，產(chǎn)生少量黑色微菌核的VBp2庫(kù)中包含1000個(gè)轉(zhuǎn)化子。從菌核型菌株V08DF1庫(kù)中篩選出14株不產(chǎn)微菌核的突變體，分別是1C2、2H3、5G4、6I7、7E6、9G4、10B5、10E1、11A6、11B

2、7、11C3、11G3、12C8、12I3。從中間型菌株VBp2庫(kù)中篩選到9株微菌核發(fā)育異常的突變體，包括4株在查氏平板上產(chǎn)紫黑色素的突變體，分別為7C8、7H4、9B1、9C10，與5株在查氏培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的突變體，分別為7F4、10B10、10C6、10E12、10G8。對(duì)上述23株微菌核發(fā)育異常的突變體進(jìn)行T-DNA插入的PCR驗(yàn)證，均能擴(kuò)增到潮霉素抗性基因。通過(guò)Southern雜交對(duì)V08DF1庫(kù)中篩選出的14株微菌核發(fā)育異常突

3、變體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明7個(gè)為單拷貝插入，5個(gè)為雙拷貝插入，2個(gè)為三拷貝插入。7株單拷貝插入的微菌核發(fā)育異常的突變菌株，分別是6I7、10B5、10E1、12C8、12I3、1C2和2H3。Southern雜交檢測(cè)VBp2庫(kù)中篩選出的微菌核發(fā)育異常的突變體，僅有突變體7F4、9B1、10E12獲得結(jié)果，這3株突變體均為雙拷貝插入。這些微菌核異常突變體的獲得為進(jìn)一步克隆參與調(diào)控微菌核形成發(fā)育的基因奠定了基礎(chǔ)。
　　由于單拷貝突變體易于

4、找出它們的T-DNA插入位點(diǎn)，可進(jìn)一步找出被破壞的微菌核發(fā)育相關(guān)基因，所以重點(diǎn)研究單拷貝插入的突變體。隨機(jī)選擇2H3和1C2這2個(gè)單拷貝插入的突變體進(jìn)行微菌核發(fā)育相關(guān)基因的研究。首先利用TAIL-PCR方法找到T-DNA區(qū)的插入位點(diǎn)，并通過(guò)與美國(guó)BROAD研究所公布的大麗輪枝菌的全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)以及NCBI網(wǎng)站上的序列進(jìn)行BLAST，找到并分析T-DNA區(qū)插入的側(cè)翼序列與微菌核發(fā)育相關(guān)基因。結(jié)果表明突變體2H3被T-DNA區(qū)破壞的基因編碼

5、conidialyellow pigment biosynthesis polyketide synthase，基因編號(hào)為VDAG_00190.1，對(duì)其基因功能成功進(jìn)行了回補(bǔ)與敲除驗(yàn)證，其中，2H3的回補(bǔ)轉(zhuǎn)化子共得到7個(gè)，并且這些轉(zhuǎn)化子的表型也都得到了恢復(fù)，敲除轉(zhuǎn)化子共得到5個(gè)，經(jīng)過(guò)了Southern雜交驗(yàn)證，確定是定點(diǎn)敲除，得到的敲除轉(zhuǎn)化子均為單拷貝，初步證實(shí)了這個(gè)基因確實(shí)與微菌核發(fā)育有關(guān)。突變體1C2被破壞的微菌核發(fā)育相關(guān)基因?yàn)橐粋€(gè)