利用基因沉默驗證大麗輪枝菌糖代謝相關基因的致病力.pdf

1、大麗輪枝菌是一種土傳性維管束病原真菌，影響多種經濟作物的產量和質量，是棉花黃萎病的病原真菌。由于大麗輪枝菌具有穩(wěn)定存在的微菌核結構以及多變的生理小種，所以其引起的棉花黃萎病至今難以防治。大麗輪枝菌全基因組序列信息的公開為研究大麗輪枝菌致病相關的關鍵基因提供了必要的數據支持，這也為在分子水平和細胞水平更好的理解大麗輪枝菌與宿主植物的互作機制及致病機理提供了可能性。
　　本實驗室對已有的大麗輪枝菌數據庫提供的VdLs17全基因組序列進

2、行初步的生物信息學分析，根據基因功能進一步劃分為:毒素蛋白相關、糖代謝相關和能量代謝相關等不同種類的基因，構建了90多個VIGS載體，并利用寄主誘導的基因沉默(HIGS)技術進行初步的表型篩選，獲得約20個表型良好的基因。本研究利用HIGS技術篩選和驗證了大麗輪枝菌糖代謝相關的5個基因VdEG1（外切葡聚糖酶，基因庫編號VDAG_02898.1）、VdENG1(內切葡糖酶，基因庫編號VDAG_10495.1)、VdMAN1（甘露聚糖內-

3、1，6-β-甘露糖苷酶，基因庫編號VDAG_07477.1）、VdPDF1（多糖脫乙?；易宓鞍?，基因庫編號VDAG_07727.1）和VdPD1（豌豆素脫甲基酶，基因庫編號VDAG_05456.1）的功能?？紤]到基因功能疊加效果，利用HIGS技術驗證上述糖代謝相關的單個基因或多個基因片段，以及編碼半纖維素酶類三個基因不同組合的融合基因片段對大麗輪枝菌致病力的影響。結果表明，上述HIGS處理的轉基因煙草病情指數、大麗輪枝菌生物量、靶基因

4、表達量都有所降低，其中VdEG1、VdPDF1的干擾效果最顯著，其次是VdMAN1和VdPD1，混合基因比單基因的干擾效果明顯;此外，3個纖維素酶類編碼基因（VdEG1、VdMAN1、VdENG1）的融合片段注射實驗表明:其干擾效果要比單基因注射的干擾效果顯著。
　　針對大麗輪枝菌糖代謝相關基因VdEG1、VdMAN1、VdPD1和VdPDF1構建基因敲除載體并轉化Vd991，最終得到vdeg11、vdeg13、vdeg14、vd

5、eg21、vdman6、vdman7、vdman9、vdman12、vdpd2、vdpd10、vdpdf9、vdpdf12這12個突變株。通過檢測突變株生長速率、產孢量、對不同碳源利用情況以及致病力，發(fā)現它們的生長速率和產孢量都有所降低。vdeg在纖維素、半乳糖、木糖、蔗糖、果膠為唯一碳源的培養(yǎng)平板上生長速率顯著降低，VdEG1在葡萄糖、木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中高表達，在葡萄糖、半乳糖、木糖、蔗糖、果糖、甘露糖的碳源營養(yǎng)下與致病因子EP