農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麗輪枝菌的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、棉花黃萎病菌引起的棉花黃萎病（Vercicillium wilt）是棉花生產(chǎn)上一種嚴(yán)重的真菌病害，在世界主要棉花產(chǎn)區(qū)都曾造成過嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國屬于產(chǎn)棉大國，多年以來一直受到黃萎病的困擾，在我國發(fā)現(xiàn)的致病菌為大麗輪枝菌（Verticillium dahlia）。目前，致病相關(guān)基因功能研究的最直接的方法是通過創(chuàng)建該基因的確是突變體，進(jìn)一步觀察突變體表型上的變化，進(jìn)而推測該基因的功能。農(nóng)桿菌介導(dǎo)（Agrobacteriumtumefaci

2、ens-mediated transformation，ATMT）的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，以其特有的有點(diǎn)成為研究真菌與其寄主互作的有力工具。
　　 本研究利用ATMT 技術(shù)，創(chuàng)建了大麗輪枝菌V-190的突變體，并對(duì)部分突變體進(jìn)行了分析，具體結(jié)果如下：
　　 （1）本文對(duì)大麗輪枝菌V-190 遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵條件、因素和參數(shù)進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，確定了最適篩選轉(zhuǎn)化子的潮霉素濃度為50μg/mL，頭孢噻肟鈉與羧卞青霉素對(duì)農(nóng)桿菌有效抑制的濃

3、度為200/200μg/mL。確定了共培養(yǎng)最佳方式是將萌發(fā)的大麗輪枝菌分生孢子與農(nóng)桿菌混合物25℃共培養(yǎng)于Fries 培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)的最佳時(shí)間為2d，從接種病斑上分離并萌發(fā)的分生孢子作為轉(zhuǎn)化受體的轉(zhuǎn)化效率最高。應(yīng)用最適的轉(zhuǎn)化條件，最終平均獲得20～30個(gè)轉(zhuǎn)化子/105分生孢子。
　　 （2）實(shí)驗(yàn)對(duì)所得的部分轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了PCR 驗(yàn)證。根據(jù)T-DNA上已知潮霉素基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)所檢測的轉(zhuǎn)化子均含有目的潮霉素