農(nóng)桿菌介導的真菌遺傳轉化及其應用

1、農(nóng)桿菌介導的真菌遺傳轉化及其應用農(nóng)桿菌介導的真菌遺傳轉化及其應用真菌在自然界具有重要的地位，它是不同生態(tài)環(huán)境中的最初分解者之一。真菌在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品行業(yè)和醫(yī)藥等領域應用十分廣泛。例如，在生物技術領域，可以利用真菌生產(chǎn)對人類有益的次級代謝產(chǎn)物抗生素、紫杉醇等；在植物病理學研究領域，許多真菌本身就是人類、動物及植物的病原菌；一些真菌可作為生防劑控制病蟲害的發(fā)生。構巢曲霉（Aspergillusnidulans）和粗糙鏈孢霉（Neurosp

2、acrassa）由于結構比較簡單，一般作為模式生物用于基礎性的分子生物學及遺傳學的研究[1]。但從自然界直接分離的菌株和通過常規(guī)育種得到的菌株在多種性狀上并不能滿足人們的需要，而通過常規(guī)方法用真菌生產(chǎn)異源蛋白更難以實現(xiàn)[2]。論文檢測。而農(nóng)桿菌介導的真菌遺傳轉化具有效率高，成本低，操作方便和重復性好等特點[34]，大大提高了真菌的轉化效率，增加了轉化子的穩(wěn)定性，為研究真菌基因功能，分離克隆相關基因提供了一條嶄新的途徑。二、農(nóng)桿菌介導真菌

3、遺傳轉化的分子基礎農(nóng)桿菌是一種土壤習居菌，在自然條件下可以通過病斑或傷口進入寄主組織，刺激寄主在侵染部位形成冠癭瘤，引發(fā)根癌病。冠癭瘤的生成，是由于農(nóng)桿菌染色體外遺傳物質Ti質粒上的一段DNA(TDNA)轉移到植物細胞，整合進染色體組并進行表達的結果。TDNA整合到真菌基因組的方式分為兩種，一種為同源重孢霉素)上，其中用一定濃度頭孢霉素殺死農(nóng)桿菌、適量選擇劑(如潮霉素)用于篩選轉化子，再繼續(xù)培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)(deGroot，1998)，并

4、且根據(jù)稀釋倍數(shù)計算出轉化效率。最后將抗性菌落轉移至新鮮含有適宜抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)[6]。四、農(nóng)桿菌介導真菌遺傳轉化的鑒定隨機挑選抗性菌落轉接到含一定濃度潮霉素B的PDA平板上，培養(yǎng)至產(chǎn)孢。挑少量孢子分別在PDA培養(yǎng)基上進行稀釋涂平板，待平板上長出肉眼可以看到的菌落時，從各稀釋板中各挑取一個菌落到新的PDA平板上，培養(yǎng)至產(chǎn)孢后，重復上述單孢分離和挑單孢培養(yǎng)過程24次，進行最后一輪單孢分離之后從各菌株的單孢分離板上隨機挑取單孢點接到含一定

5、濃度的潮霉素B的PDA平板上培養(yǎng)，觀察各板上單孢分離菌塊的生長情況，若所有菌塊都生長則說明該轉化子穩(wěn)定，反之則表明該菌株不具有遺傳穩(wěn)定性，若部分菌塊生長則表明TDNA插入存在分化現(xiàn)象。以真菌菌株作對照。挑取野生型真菌菌株和假定轉化子菌株分別接種在PDA培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)至產(chǎn)孢，向平板中加入適量滅菌水洗下分生孢子，吸取適量孢子液接種到盛有PDA培養(yǎng)基的三角瓶中震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后，將培養(yǎng)物利用真空抽濾泵收集菌體，收集的菌體用滅菌蒸